论文部分内容阅读
随着经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉搭桥术等再灌注治疗技术的发展，防治缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)成为治疗急性缺血性心肌病亟待解决的重要问题之一。山莨菪碱(Anisodamine，Ani)是一种源于茄科植物唐古特山莨菪根的生物碱，1965年由我国率先应用于临床治疗。近年来不少的研究报道了山莨菪碱在缺血再灌注损伤中具有心肌保护功能，能够减少心肌梗死面积，改善微循环、防止再灌注心律失常及无复流现象的发生。然而迄今为止，山莨菪碱预防和改善心肌缺血再灌注损伤的机制尚不明确。 心肌细胞上存在两种ATP敏感的钾通道:分别是位于细胞膜上的ATP敏感的钾通道，及位于线粒体膜上的ATP敏感的钾通道。最近的药理学和分子生物学研究发现，缺血引发的代谢紊乱导致ATP敏感的钾通道开放，对缺血再灌注损伤器官具有保护作用，特别是线粒体上ATP敏感的钾通道在器官保护中发挥着关键作用。那么，前期发现的山莨菪碱对缺血再灌注心肌的保护作用是否由ATP敏感的钾通道(KATP)中介尚不清楚。本研究利用大鼠心肌缺血再灌注模型，观察线粒体ATP敏感钾通道阻断剂5-羟基葵酸（5-HD）对山莨菪碱保护心肌缺血再灌注损伤的影响，探讨山莨菪碱的作用机制，为临床应用山莨菪碱防治心肌缺血再灌注损伤提供理论依据。 方法:成年雄性Sprague-Dawlay(SD)大鼠36只（体重250-320g），随机分为4组（每组9只）:假手术组(Sham)冠状动脉左前降支(left anterior des-cending coronary artery，LAD)根部穿线，不结扎，观察时间同缺血再灌注组时间;缺血再灌注组(I/R)结扎LAD40分钟，再灌注180分钟;山莨菪碱组(Ani)结扎LAD40分钟，再灌注前5min静脉注射山莨菪碱10mg/kg，再灌注180分钟;山莨菪碱+5-HD组(Ani+5-HD)结扎冠状动脉LAD40分钟，再灌注前10min静脉注射5-HD，10mg/kg，再灌注前5min静脉注射山莨菪碱，10mg/kg，再灌注180分钟。前期实验报道5-HD对缺血-再灌注损伤没有明显影响，故本课题未设置单独使用5-HD的缺血再灌注组。实验过程中描记Ⅱ导联心电图，以ST段抬高，T波电压升高，作为成功结扎LAD的标志。再灌注结束时，颈动脉取血，离心后提取上清，全自动生化仪检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)及肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)含量。取出心脏，留取结扎线以下部分心肌迅速置于液氮冷冻后-80℃保存，用于后续荧光素酶法测定心肌ATP含量，剩余心肌每组取两只进行透射电子显微镜观察心肌细胞超微结构，其余四只大鼠心肌进行TTC染色后，利用计算机分析软件Image-Pro Plus分析各组心肌梗死面积所占比例。 实验中排除造模失败大鼠，共27只大鼠被纳入实验，其中Sham组8只、Ani组7只、I/R组及Ani+5-HD组各6只。各组大鼠的一般状况无明显差异。 结果: 1心电图变化情况 术前心电图均为正常心电图。将同步心电图出现ST段迅速抬高，T波电压升高，QRS波群增宽作为成功结扎大鼠LAD的标志;将ST段下降50％以上及T波回落，作为松解LAD恢复灌流标志。部分大鼠再灌注早期出现房室传导阻滞、室性心动过速、心室颤动等再灌注心律失常。 2梗死面积比较 缺血再灌注引起明显的心肌坏死，I/R组梗死面积为44.06±1.7％，与I/R组相比，Ani组梗死面积(22.50±1.1％)显著缩小(P＜0.05)，表明Ani对心肌缺血再灌注具有显著的保护作用，而加用5HD后(Ani+5-HD组)梗死面积为40.50±2.2％，表明5-HD显著减弱Ani的保护作用。 3血清心肌酶 (1) Sham组、I/R组、Ani组及Ani+5-HD组的CK-MB分别为:(695.67±43.02) U/L、(3414.33±201.64) U/L、(2014.50±153.43) U/L、(2798.50±223.99) U/L。与Sham组相比，I/R组的CK-MB含量明显升高(P＜0.05)，Ani组较I/R组明显降低(P＜0.05)，Ani+5-HD组较单用Ani组显著升高(P＜0.05)。 (2) Sham组、I/R组、Ani组及Ani+5-HD组的LDH分别为:(635.83±52.66) U/L、(2647.17±138.50) U/L、(1798.83±71.55) U/L、(2064.50±82.07) U/L。与Sham组相比，I/R组的LDH含量明显升高(P＜0.05)，Ani组较I/R组明显降低(P＜0.05)，Ani+5-HD组较单用Ani组显著升高（P＜0.05） 4心肌ATP含量 Sham组、I/R组、Ani组及Ani+5-HD组的ATP含量分别为:(8.10±0.23) nmol/mg protein、(2.64±0.16)nmol/mgprotein、(4.77±0.24) nmol/mgprotein、(3.6±0.20) nmol/mgprotein。与Sham组相比，I/R组的ATP含量明显降低（P＜0.05），Ani组较I/R组明显升高（P＜0.05），Ani+5-HD组较单用Ani组显著降低(P＜0.05)。 5心肌超微结构 Sham组:大鼠心肌组织及线粒体结构正常，嵴突与肌原纤维排列整齐，糖原颗粒丰富;I/R组:心肌纤维消失，线粒体嵴融合或缺失，线粒体可见部分空化现象，糖原颗粒减少。Ani组:心肌组织损伤较I/R组明显减轻，心肌纤维轻度水肿，线粒体轻度肿胀、线粒体嵴和膜有断裂现象，糖原颗粒较丰富;Ani+5-HD组:心肌纤维部分消失，线粒体有不同程度病变，出现空化现象，线粒体部分嵴融合或缺失，糖原颗粒明显减少。 结论:山莨菪碱后处理具有明显的抗心肌缺血/再灌注损伤作用，表现为显著缩小心肌梗死面积，降低血清CK-MB、LDH含量，增加心肌ATP含量，保护心肌超微结构。线粒体ATP敏感钾通道阻断剂5-羟基葵酸可显著拮抗山莨菪碱的心脏保护作用，提示山莨菪碱的心肌保护作用与开放线粒体膜ATP敏感钾通道有关。