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人鼻病毒(Human Rhinovirus,HRV)是引起人类感冒最重要的病原体之一。HRV可以引起约50%以上的上呼吸道感染,也是儿童急性下呼吸道感染的主要病原。HRV感染可以诱发儿童哮喘的急性加重,并且与慢性阻塞性肺病(chromic obstructive pulmonary disease,COPD)相关。内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)是当内质网出现一系列功能紊时细胞做出的适当性反应。内质网(endoplasmicreticulum,ER)是蛋白质正确折叠修饰的场所,也是钙的储存场所。当缺氧、蛋白错误折叠、钙失衡和感染发生时,ERS会激活未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse,UPR)来降低细胞异常状态,从而保护细胞。有研究证明ERS在支气管哮喘中发挥重要作用,呼吸道平滑肌胞浆钙离子浓度的增加对气道高反应性和气道重塑有很大影响。为探讨HRV能否引起ERS及具体调控机制,本研究以人鼻病毒16型(HRV 16)和非结构蛋白2B为研究对象,探讨HRV 16及其2B蛋白引起ERS 标志性蛋白葡萄糖调节蛋白 78(glucose regulated protein 78 kD,GRP78)和三条典型信号分子(PERK、ATF6和IRE1)的变化特点。使用MOI=5的HRV 16 接种 H1-HeLa 细胞 3h、6h 和 9h 后,Western Blot 结果显示 GRP78含量随病毒感染时间的延长逐渐增加,提示HRV 16感染诱导细胞产生ERS。随后,检测HRV 16感染对蛋白激酶R样内质网激酶(proteinkinase R-1 like ER kinase,PERK)及其下游真核翻译起始因子 2α(eukaryoticinitiationfactor 2α,eIF2αα)磷酸化水平。Western Blot显示,随HRV16感染时间持续增加,p-PERK和p-eIF2α表达量增加,而PERK和eIF2α表达量没有变化。同时,检测HRV16感染对ATF6途径影响。当活化转录因子6(activating transcription factor-6,ATF6)途径被激活时,90kDa的ATF6将被切割成50kDa有活性的ATF6(cleaved-ATF6),结果显示 HRV 16 感染 H1-HeLa 时,cleaved-ATF6 表达量随着感染时间的增加而增加。第三条途径为需肌醇酶1(inosito1-requiring enzyme-1,IRE1)途径。当IRE1被激活时,p-IRE1剪切X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)mRNA的26个核苷酸,形成有活性转录因子XBP1s。然而,HRV16感染H1-HeLa细胞后,随着感染时间增加p-IRE1含量逐渐降低。而且,mRNA水平并未出现XBP1s条带,提示HRV 16通过PERK和ATF6途径而不通过IRE1通路引起ERS。为了解非结构蛋白2B在HRV 16诱导ERS中的作用,构建了 2B蛋白的真核表达载体pcDNA3.1-2B-Flag。利用蛋白二级结构分析软件发现,2B蛋白含有2个疏水区,采用激光共聚焦显微镜观察到非结构蛋白2B与ER发生共定位,提示2B蛋白定位于ER。随后,将pcDNA3.1-2B-Flag转染H1-HeLa,分别于转染后 12 h、24 h 和 36 h 检测 ERS 标志性蛋白 GRP78 和三条典型信号通路分子的表达。结果发现,随着质粒转染时间的增加,GRP78,p-PERK,p-eIF2α,cleaved-ATF6 含量均增加。同时 ATF6 和 PERK-eIF2α 下游的ATF4转录活性也增加,提示2B蛋白激活了 PERK途径和ATF6途径。然而,2B蛋白未激活IRE1途径,mRNA水平未检测出XBP1s条带,与HRV 16感染H1-HeLa的结果相似。为了明确HRV 16感染及其非结构蛋白2B引起p-IRE1 水平降低的原因,使用钙调神经磷酸酶(CaN)抑制剂环孢素A(Cyclosporin A,CsA)分别作用于HRV 16感染细胞和pcDNA3.1-2B-Flag转染细胞。Western Blot显示,CsA抑制了 HRV 16感染细胞和非结构蛋白2B转染细胞引起的p-IRE1降低。同时,为了明确HRV 16和非结构蛋白2B是否通过钙离子诱导CaN活性增加,使用钙离子螯合剂BAPTA-AM分别作用HRV 16感染细胞和非结构蛋白2B转染细胞,检测发现未加BAPTA-AM的HRV16和非结构蛋白2B诱导CaN活性增加,而BAPTA-AM明显抑制了这一过程的CaN活性。实验结果证明HRV 16和2B蛋白通过诱导胞浆钙离子增加激活CaN,从而使p-IRE1去磷酸化。为了进一步确定2B蛋白是否通过钙离子激活PERK和ATF6途径,使用BAPTA-AM作用于pcDNA3.1-2B-Flag转染的H1-HeLa,与对照相比,BAPTA-AM作用后p-PERK和cleaved-ATF6含量明显下降。通过Fluc实验证实,BAPTA-AM抑制了 ATF6和PERK下游ATF4的转录活性。结果证明HRV 16 2B蛋白通过提高胞浆中钙离子浓度激活PERK和ATF6途径。为了了解ATF6、PERK和IRE1通路对HRV 16病毒复制的影响,在空斑形成实验中分别加入ATF6抑制剂(AEBSF)、PERK抑制剂(GSK2656157)和IRE1抑制剂(STF-083010)。结果表明,AEBSF和GSK2656157可以有效抑制病毒复制,而STF-083010不能抑制病毒复制。结果证明HRV16病毒可以激活细胞ERS的ATF6和PERK途径而促进病毒复制。总之,HRV 16和非结构蛋白2B可引起细胞胞浆钙离子增加,激活PERK通路和ATF6通路而诱导内质网应激。HRV 16和非结构蛋白2B通过增加细胞胞浆钙离子激活CaN使得p-IRE1去磷酸化。研究结果对于预防和治疗鼻病毒感染引起的呼吸道疾病可以提供一定的理论基础。