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戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是一种人畜共患性病原,因其广泛的跨物种间传播流行病学特征可能造成对我国食品安全与公共卫生安全领域的严重威胁。本研究利用贝类非选择性天然富集病毒的作用特点,通过建立分子生物学检测手段调查HEV在近海水域中贝类体内的污染分布情况。并结合国际食品法典委员会(CAC)中的微生物风险评估基本理论对我国贝类中HEV感染风险评估建立了一套参考数据模型。评估数据可为我国食源性HEV的监测与防控工作提供科学依据。另外,本研究还进一步地开展了 HEV基因工程重组活载体乳酸菌的研究。上述具体研究结果如下:1.贝类中HEV的分子检测方法的建立首先利用RNA装甲技术制备了 HEV分子检测阳性质控品,并在此基础上进行了贝类中HEV分子检测新方法的研究,包括贝类中HEV的富集与多种RT-PCR检测方法的研究,并对其有效性进行了系统分析。分析结果表明:①获得的假病毒颗粒可作为通用HEV基因1-4型RT-PCR检测的标准品和质控品;②改进的贝类中HEV的富集方法病毒回收率达5-14%。③建立的针对4型HEV的nRT-PCR和RT-LAMP方法特异性高、敏感性与国际参考方法qRT-PCR相当,分别达到了 2.5×102copies 和 101 copies/μL。2.贝类中HEV的污染调查与遗传进化树分析通过本研究建立的HEV nRT-PCR方法对我国环黄、渤海地区的近海水域中贝类的污染状况进行了调查。调查结果显示,①近海水域中平均每公斤贝类HEV污染率达17.5%,受污染的地区有7个;②经qRT-PCR鉴定,泥蚶、红蚶和杂色蚶三种贝类中HEV污染含量分布在6.23 × 102到6.36 ×103基因拷贝数范围内,且统计学差异显著(p<0.05);③利用Mega6.0软件将新分离鉴定的13株HEV基因序列进行遗传进化分析,结果表明所有新分离株的基因均为HEV基因4型(G4)HEV,与人和猪源HEV亲源关系相近并且可继续划分成G4b、G4d以及一个未知亚型群组。3.贝类中HEV风险评估本研究针对贝类中HEV污染调查情况以及相关膳食调查数据,利用CAC的MRA方法对该地区贝类中HEV进行了定量风险评估。结果发现环黄-渤海地区三省一市的居民每餐食用贝类引发感染HEV的平均概率为0.000300055(约百万分之三);预计年均每百万人感染比率约为0.4%;预计每年0-14岁、和14岁以上人口的感染数分别为49 722、755 707人,合计805 429人。本次评估由于采用了近似人类的灵长类动物的消化道途径HEV的剂量反应参数,因此存在一定的不确定性。4.戊型肝炎病毒衣壳蛋白乳酸菌展示系统的构建与免疫学评价① Western blotting和IFA鉴定结果表明,本研究设计构建的重组质粒pNZ8149-inaQN-ORF2能够将少量的HEV衣壳蛋白ORF2经INP膜锚定蛋白表达展示于宿主菌L.lactis NZ3900表面。②小鼠粘膜特异性抗体IgA的ELISA检测结果表明,口服免疫重组菌L.lactis NZ3900能够很好地刺激小鼠消化道、呼吸道和泌尿生殖道的粘膜免疫应答。与对照菌体组相比,特异性抗ORF2抗体IgA在消化道和呼吸道中水平可从首免后的第35天到第63天维持在较高水平而在泌尿生殖道中只能维持到首免后的第49 天(P<0.05,P<0.01)。③小鼠血清中特异性抗体IgG的ELISA检测结果表明,口服免疫重组菌L.lactis NZ3900能够有效刺激小鼠产生针对ORF2抗原的系统性免疫应答。与对照菌体相比,特异性抗ORF2抗体IgG滴度可高水平维持在首免后的第21天到第63天。④小鼠脾T淋巴细胞增殖的CCK-8检测结果表明,在首免后的第35至63天内,实验组脾T淋巴细胞增殖能力显著高于对照组(p<0.05,p<0.01)。⑤小鼠细胞因子分泌水平的ELISA检测结果表明,在首免后的第49天,ELISA检测免疫小鼠脾T淋巴细胞分泌IL-4水平显著高于对照组(P<0.01),而IFN-y的分泌水平在实验与对照组之间无差异。提示针对Th2介导的细胞因子的上调得到加强。