着色芽生菌病是一种慢性的皮肤和皮下组织肉芽肿性真菌感染。着色芽生菌病病原菌主要有着色霉菌属(裴氏着色霉、Fonsecaea monophora)、枝孢霉属(卡氏枝孢霉、播水喙枝孢)及疣状瓶霉，其中裴氏着色霉、卡氏枝孢霉最常见。在我国报道中，卡氏枝孢霉最常见于北方干燥寒冷地区，而裴氏着色霉多见于南方温热潮湿地区。2004年，De Hoog等通过对多株裴氏着色霉的rDNA内转录间隔区(ITS)序列分析，发现一些以往被形态学鉴定为裴氏着色霉的菌株实际上应该是一个新的种类，并将其命名为Fonsecaea monophora(Fmonophora)。Fonsecaea pedrosoi(F.pedrosoi)引起的着色芽生菌病多表现局限性感染，但F．monophora还可引起系统感染，更具有危害性。我们最近将广东近年来从临床患者中分离的裴氏着色霉重新进行分子生物学鉴定，发现以F．monophora为主，而非F.pedrosoi。 着色芽生菌病病程慢性，治疗比较困难且易复发，部分患者发病部位可以发生癌变，严重影响患者生活质量甚至丧失工作能力。虽然很多学者对裴氏着色芽生菌的致病性、宿主的免疫应答及治疗等方面进行了一些探讨，但迄今为止对Fonsecaea monophora的致病性没有明确的阐述。目前对部分机会性致病真菌的致病性研究表明，致病真菌进入宿主后，通过一系列的反应来适应宿主体内的环境，伴随一些基因的高表达而导致其形态改变，抵抗宿主的免疫杀伤。在真菌形态改变发生的机制研究中，发现Cdc42基因在致病性真菌的致病相形成过程中发挥重要的作用。Fonsecaea monophora生命周期中存在腐生态的菌丝体、繁殖态的分生孢子及寄生态的硬壳小体，大多数学者认为体内寄生态的硬壳小体是着色芽生菌为了适应宿主体内的环境而发生的形态改变。因此，研究Fonsecaea monophora Cdc42基因在其转变成硬壳小体中的作用，将为明确该病的发病机制和开发针对相应靶点的抗真菌新药提供理论依据。 临床上，抗真菌药物的作用因耐药性的产生和发病部位皮肤组织的严重纤维化而导致治疗效果欠佳。为了研究着色芽生菌病的发病机制和开发新的抗真菌药物的疗效，很多学者建立该疾病的动物模型，但是相关报道的动物模型无论在宿主的免疫状态还是感染途径，均没有真正模拟临床着色芽生菌病的发病过程，因此建立理想的着色芽生菌病动物模型对阐明该疾病的发病机制及正确评价治疗药物的疗效具有重要的意义。本课题拟从探讨Cdc42基因在硬壳小体形成中的作用及建立理想的慢性感染的动物模型，来进行Fonsecaea monophora的致病性研究。 第一部分 Fonsecaea monophora Cdc42的克隆及表达分析 目的： 1、鉴定及克隆Fonsecaea monophora Cdc42基因，分析该基因在菌丝体、分生孢子及硬壳小体中的表达。 2、探讨其在Fonsecaea monophora形态转变中的作用。 方法： 1、设计简并引物，通过简并PCR，获取Fonsecaea monophora Cdc42基因的表达序列标签，在此基础上应用RACE技术获取该基因的5’端和3’端的序列，应用Sequencher软件拼接获取基因全长cDNA序列，并进行生物信息学分析。 2、设计添加含BamHI和EcoRI酶切位点的上游及下游引物，获取Fonsecaea monophora Cdc42的开放阅读框，构建pcDNA6/myc—His B—Cdc42质粒，转染vero细胞，诱导重组蛋白的表达。SDS—PAGE电泳，Western blot蛋白免疫印迹法检测Cdc42p蛋白表达水平。 3、体外诱导Fonsecaea monophora的菌丝体、分生孢子及硬壳小体；以β—Tubulin为内参，应用ABI PRISM7000 Real Time RT—PCR扩增仪检测三种形态Cdc42基因表达的水平。以2-△△Ct分析法进行组间相对定量分析。组间多重比较采用方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。 结果： 1、通过简并PCR，获得423bp的序列，经网上查询比对，该序列与皮炎外瓶霉Cdc42基因具有98％的同源性，确定为Fonsecaea monophora Cdc42的序列表达标签。 2、通过RACE方法，获得492bp5’端和655bp3’端的序列，与Fonsecaea monophora Cdc42的序列表达标签均有重叠序列。经拼接获得1510bp的cDNA全长序列，经生物信息学分析，该序列包含582bp的开放阅读框，编码193个氨基酸；通过比较该基因基因组DNA与cDNA序列，发现该基因组包含5个外显子和4个内含子，通过剪切位点分析，符合GT/AG法则；预测的蛋白质序列与皮炎外瓶霉的Cdc42蛋白质具有99％的同源性；预测该蛋白质的分子量为21.5kDa等电点为5.67。 3、采用pcDNA6/myc—His B载体构建Cdc42编码区的真核表达质粒，克隆后筛选的阳性重组子经PCR、酶切、测序鉴定，读码框和插入方向完全正确。通过脂质体介导将重组体pcDNA6/myc—His B—Cdc42瞬时转染vero细胞，用SDS—PAGE检测其在vero细胞中的表达，约在27.5 kDa处可见外源基因的融合蛋白表达，即Cdc42蛋白质21.5kDa加上前myc—his标签的分子量为6.0kDa。 4、成功体外诱导Fonsecaea monophora的菌丝体、分生孢子和硬壳小体。通过Real time PCR，检测Cdc42基因在三种形态中的表达，结果显示Cdc42基因在硬壳小体中表达最高，其次为分生孢子，菌丝体表达最低。以菌丝体为对照，硬壳小体的表达量为其7.02倍，而分生孢子的表达量是其1.65倍，硬壳小体与分生孢子及菌丝体之间的表达量均存在统计学差异(P<0.01)。而分生孢子与菌丝体之间的表达量无统计学意义(P>0.05)。 结论： 成功克隆了Fonsecaea monophora Cdc42基因，并发现该基因在硬壳小体中表达最高，可能该基因参与了硬壳小体的形成。 第二部分慢性皮肤感染Fonsecaea monophora动物模型的建立 目的： 建立免疫正常的慢性皮肤感染Fonsecaea monophora的动物模型，观察其致病性。 方法： 选择25只免疫正常的Wistar大鼠，分为2组，20只为实验组，左边背部为皮内接种，右边背部为皮下接种，5只为对照组。实验组注射0.2ml含1×107CFU/ml的菌悬液，对照组注射相同体积的生理盐水。在接种后的不同时间内观察背部皮损的大小及表面的变化；接种后的第2、3、4、5周分别抽取脓液，观察体内真菌形态的变化；接种后的第1、2、3个月，进行皮损的组织活检，观察皮损的组织病理变化。实验结束后，所有大鼠内脏组织进行组织培养。 结果： 实验组在接种后的第3～4天出现质硬小结节，结节逐渐增大变软，在接种后的第3～4周达到最大，皮内接种为0.85 cm，皮下接种为1.12 cm，然后逐渐缩小，在第3个月时，皮内接种缩小到0.1 cm，而皮下接种则为0.6 cm。皮内接种组：接种后不同时间，皮损逐渐增大变软，表面出现坏死、溃疡，形成暗红色痂，后来皮损逐渐变平、轻微萎缩伴黑色痂。皮下接种组：在整个实验过程中，皮损未出现溃疡和结痂。实验组接种后第2、3、4、5周，可从皮损处抽出粘稠的脓液，采用10％KOH直接涂片镜检，发现真菌的形态分别为棕色的萌芽菌丝、枝状链的芽生孢子、分隔的串状芽生孢子及出现单个的硬壳小体。皮内接种后第3个月取皮损组织进行病理学检查，真皮层可见典型的肉芽肿性炎症改变，多核巨细胞内见硬壳小体。在整个实验过程中，皮下接种皮损的组织病理未见明显的变化，广泛的炎症浸润带包裹坏死区，炎症带由组织细胞、中性粒细胞、硬壳小体、短片段的菌丝组成。 结论： 成功建立了免疫正常Wistar大鼠慢性皮肤感染Fonsecaea monophora的动物模型。