丁香假单胞菌是一种诱发植物冻害的致病细菌，而这种诱发植物冻害的关键因素则为其自身产生的一种分泌蛋白，冰核蛋白（Ice nucleation protein）。本课题以研究冰核蛋白INP的分泌机制为目标，利用“自杀性”转座子pUT-mini Tn5-Km2构建突变文库。　　突变文库构建中所选用的受体菌株为本实验室分离的一株具有高冰核活性的丁香假单胞菌MB03，MB03菌体INP基因inaQ已完成克隆测序(GenBank登录号：EU360731)，所构建的转座子突变文库为丁香假单胞菌MB03突变文库。转座过程借助于双亲本接合转移来完成，同时需要Mg2+进行诱导。转座突变子的筛选则选用卡那霉素（Kan）与MG培养基的双重筛选作用。突变菌株是否完成pUT骨架结构“自杀”验证采用氨苄青霉素（Amp）与卡那霉素（Kan）的抗性对照实验进行。构建完成的突变文库中共有突变菌株1265株，且每一株突变菌株都经过“自杀性”验证。　　根据已知INP基因全长序列设计引物，扩增获得INP基因N端序列与部分中间重复序列共999bp，连接pET-28a表达载体，表达纯化获得INPN蛋白并制备INP蛋白抗血清。本实验突破传统的小液滴冻结法测定冰核活性的方法，创新性的以反应更灵敏，结果更准确的免疫学手段来进行INP分泌的定量分析。以膜杂交的方法对突变文库中的突变菌株进行初步筛选，并进行复筛精确实验结果。从中筛选出10株INP分泌突变菌株，其中6株INP分泌增强突变菌株，4株INP分泌减弱菌株。　　将膜杂交筛选出来的突变菌株进行Cy5流式细胞仪(FCM)检测，对INP与INP抗体表面结合率以及Cy5荧光强度进行对比分析。结果表明突变菌株所分泌锚定于细胞表面的INP与其抗体的表面结合率均有所增强，但不同突变菌种的平均荧光强度却有较大的差异。对突变菌株进行Cy3免疫荧光显微镜观察，在Cy3激发波长下能清楚的看到菌体分泌到膜外的INP与抗血清反应所产生的红色荧光。　　对突变菌种中转座子插入位点的鉴定采用的是反向PCR的方法。从中选择INP分泌增强与减弱菌株各2株，对其基因组进行抽提与随机酶切，将酶切产物环化形成自连环化片段。通过转座子两侧的已知序列设计两对反向引物，分别对环化产物进行两轮扩增，以减少非特异性条带对扩增的影响。通过测序手段获知转座子插入位点周边序列信息，并与MB03基因组序列进行对比。但对于转座子插入位点的鉴定受多方面因素共同制约，如：酶切不匀，PCR特异性较差，测序结果的差异等均会对其定位造成极大的影响。