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鉴于定向共价固定化的理论,我们希望能在固定化过程中实现定向吸附.为此,我们选用了三种亲水性有差别的载体来吸附酯酶BioH,通过红外光谱扫描和接触角的测量,经过亲水基团修饰的聚苯乙烯大孔吸附树脂的疏水性有所下降。接着通过Chimera软件的分析,我们也发现酯酶BioH的活性中心远端有一块完全没有疏水氨基酸残基的极性区域的存在,其巯水氨基酸残基在数量上也是和其他区域有明显的区分。结果证明,这个区域对固定化过程中的酶的朝向起了关键作用。极性区域和极性树脂上的基团的结合,使吸附过程中酶的活性中心有朝外的趋势,从而减少活性中心倒扣在载体上带来的传质限制。所以在亲水性载体上,固定化酶表现出了最高的比活力。这和通过特殊氨基酸在活性载体上共价结合很类似,因此我们称之为定向吸附固定化,
我们考察了固定化酶在载体上的吸附过程特点以及游离酶和固定化酶在有机相反应中的差别.在吸附过程中,作为经常用来稳定酶结构和增强酶和载体连接键的戊二醛不仅没有提高酶的载量,而且也影响了酶的活性。所以有些酶可能自身结构的稳定性局限,不适应用戊二醛来稳固酶的固定化.
固定化酶和游离酶的最佳温度都在50℃左右,比其在水相中的最佳反应温度37℃要高,说明在有机相中酶的结构比在水相里更稳定,更不容易变性。并且,我们还发现,在温度较高的情况下,固定化酶比游离酶的活性要高,也体现了固定化酶在蛋白结构稳定方面的成功。热稳定方面,固定化酶也比游离酶要更优秀,同样也说明了固定化酶在稳定结构方面的作用。
通过不同有机溶剂的影响和水活的影响研究了有机相中水的影响。固定化酶和游离酶在巯水性强的溶剂中表现出来更高的活力,因为巯水性强的溶剂能提供给酶更多的水分子.随着水活的升高,固定化酶和游离酶的活性都呈现了上升的趋势。固定化酶的活力在水活发生变化时更稳定,主要是载体的亲水基团起到了结合水分子的作用。
虽然吸附法没有很强的共价键结合,但是其在有机相中的反应能有利于其稳定性.另外底物在载体上的强吸附,导致酶和底物的亲和性被动加强,酶的动力学常数Km在固定化之后上升。