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目的：胃癌在我国是最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率目前仍居恶性肿瘤首位。因其发病较隐匿,常不能早期发现及诊断,导致其致死率居高不下。手术切除是目前唯一可能根治胃癌的手段,但对于进展期胃癌即使行胃癌根治术,临床五年生存率仍徘徊在50%左右,且术后患者生活质量明显下降。较早出现的癌细胞转移是导致进展期胃癌不良预后的主要原因,但目前对于胃癌转移的分子机制的了解仍然是属于知之甚少的领域。近年来的研究指出,趋化因子CXCL12与其特异性受体CXCR4所构成的CXCR4/CXCL12生物学轴在多种肿瘤的播散和器官特异性转移中发挥着重要的作用。但CXCR4在胃癌侵袭、转移中的作用及机制仍然存在较大争议。为此,本研究首先观察胃癌不同组织中CXCR4/CXCL12的表达及其与胃癌临床病理参数包括患者生存率之间的关系,同时检测四种不同人胃癌细胞系中CXCR4基因mRNA的表达状况；其次,构建CXCR4-shRNA重组腺病毒真核表达载体转染人胃癌细胞系SGC7901,以特异性抑制胃癌细胞SGC7901中CXCR4的表达,观察其阻抑效应；最后,建立裸鼠胃癌原位移植瘤模型,对比观察移植前后的胃癌细胞在动物体内的生物学性状,由此揭示CXCR4在胃癌侵袭和转移中的作用并初步探讨其机制,为胃癌侵袭转移的防治提供新思路。方法：1、收集辽宁医学院附属第一医院普通外科2008年2月至2009年2月外科手术切除的85例新鲜胃癌组织标本及距肿瘤边缘5cm以上的正常胃组织41例。应用免疫组织化学方法检测不同组织内CXCR4和CXCL12的表达情况,系统分析它们与临床病理参数之间的关系,研究二者在胃癌不同组织中的表达与胃癌侵袭转移的关系。用RT-PCR方法分别检测4种人胃癌细胞株中CXCR4mRNA的表达情况。2、在GENBANK中检索基因CXCR4序列,设计3条短发夹RNA (shRNA)并经同源性检索无误后合成,利用PCR、酶切及DNA连接构建真核表达载体shpDown-hCXCR4-eGFP,挑取阳性质粒送交阳性克隆测序鉴定后,再根据Gateway技术将真核表达载体嵌入到PL-Dest腺病毒骨架载体(pAd/PL-Dest)中,经基因测序、PCR及Pac I酶切鉴定获得重组腺病毒载体shpAd-hCXCR4-eGFP。同理构建对照组shpAd-control-eGFP。去内毒素超纯提取该重组腺病毒质粒,经Pac Ⅰ酶切电泳后凝胶回收大片段,提纯并通过脂质体Lipofectamine2000介导转染HEK293A细胞,通过eGFP基因绿色荧光表达检测转染情况并进行病毒包装,采用终点稀释法进行病毒滴度测定。以最佳感染复数(MOI)转染胃癌细胞SGC7901后,利用RT-PCR和Western-blot方法检测各组沉默效率,筛选出沉默效率最高的一组。3、分别以最佳MOI转染实验组和阴性对照组,并设立空白对照组。将转染后的胃癌细胞分别利用RT-PCR和Western-blot检测重组腺病毒载体沉默CXCR4基因mRNA和蛋白的表达情况；通过MTT法利用吸光度绘制SGC7901细胞生长曲线,检测重组腺病毒载体对胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用；通过Transwell小室对细胞迁移侵袭能力进行检测,获得重组腺病毒载体对胃癌细胞SGC7901侵袭力的影响参数。4、构建人胃癌细胞SGC7901裸鼠腹腔原位移植瘤实验动物模型,观察CXCR4-shRNA腺病毒载体对胃癌细胞裸鼠腹腔移植瘤生长及转移的影响；应用Western-blot方法检测腹腔转移瘤组织内的CXCR4、VEGF-C和MMP-2蛋白的表达情况。结果：1、正常胃组织中均未检测到CXCR4基因的阳性表达(0/41);CXCR4在胃腺癌组织中的阳性表达率明显增高,85例胃癌组织中CXCR4染色阳性59例,63例淋巴转移癌中CXCR4阳性表达56例,17例肝脏转移癌中CXCR4阳性表达15例,12例腹膜转移癌中CXCR4阳性表达12例,染色阳性率分别为69.4%、88.9%、88.2%和100%,除淋巴与肝脏转移癌外,各组间相比均具有显著性差异(P<0.05)。在胃腺癌原发灶中CXCR4和CXCL12的表达与大体形态(二者P均<0.01)、浸润深度(二者P均<0.05；进展期>早期)、肿瘤对淋巴管(两者P均<0.01)和血管(两者P均<0.01)的侵袭、淋巴结(两者P均<0.01)肝脏(两者P均<0.01)和腹膜(两者P均<0.01)转移有关,且二者表达呈正相关；而与年龄(≤65岁与>65岁)(P分别为0.352和0.417)、性别(P分别为0.55和0.20)、肿瘤位置(P分别为0.65和0.09)和肿瘤大小(P分别为0.10和0.30)无关。CXCR4阳性表达胃癌组患者3年生存率为44.07%,明显低于CXCR4阴性表达组65.38%,两组生存率间差异有显著性意义(P<0.05)。CXCR4mRNA在4株细胞株中的2株(SGC7901和BGC-823细胞株)中高表达,而在SNU-1和NCI-N87细胞株中低表达。2、经基因测序、PCR检测及酶切鉴定表明,重组腺病毒真核表达载体shpAd-hCXCR4-eGFP构建成功,同时成功构建阴性对照病毒载体shpAd-control-eGFP。3、荧光倒置显微镜下观察到转染重组腺病毒表达载体及其阳性、阴性对照的HEK293A细胞内有大量绿色荧光表达并有明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)腺病毒包装成功,病毒滴度检测为4X109PFU/ml。最佳MOI=100,腺病毒载体最佳转染体积为12.5μ1。4、将shpAd-hCXCR4-eGFP转染至胃癌细胞SGC7901后,检测RT-PCR及Western blot结果表明：CXCR4-shRNAl组的CXCR4mRNA及蛋白表达量明显低于其他两组,具有显著性差异(P<0.05)；三组实验组与空白组具有显著性差异(P<0.01)。测定CXCR4-shRNAl组沉默效率最高,沉默效率为78.08%。5、将CXCR4-shRNAl转染至胃癌细胞SGC7901后,MTT法绘制生长曲线,结果表明：空白组与对照组细胞生长迅速,两组之间无显著性差异(P>0.05),实验组经腺病毒载体转染后细胞增殖程度显著减少,与前两组相比有显著性差异(P<0.05)。6、细胞侵袭实验结果表明：在CXCL12的趋化24h后,空白组、阴性对照组和实验组三组穿膜的细胞数量分别为264.7±15.7、270.5±16.9、113.8±9.2,shRNA-CXCR4腺病毒载体组比较空白组和对照组穿膜细胞数量明显减少,具有显著性差异(P<0.05)。而空白组与对照组相比数值没有明显的减少,无显著性差异(P>0.05)。7、成功构建三组胃癌细胞裸鼠腹腔原位移植瘤模型,与SGC7901组、空病毒组相比,CXCR4-shRNA组腹水产生时间明显延后且量较少,具有显著性差异(P<0.05)；腹腔各脏器转移瘤的个数、重量、直径均要低于后两者,具有显著性差异(P<0.05)；抑瘤率达到68.1%；裸鼠存活时间延长,存活率较高,生命延长率达到40.4%,具有显著性差异(P<0.05)。而SGC7901组与空病毒组对比,以上结果均无显著性差异(P>0.05)。Western Blot检测三组转移瘤组织CXCR4、VEGF-C和MMP-2蛋白表达情况,结果显示CXCR4-shRNA组与SGC7901组、空病毒组相比,CXCR4、VEGF-C和MMP-2蛋白表达低,具有显著性差异(P<0.01); SGC7901组与空病毒组两组相比,CXCR4、VEGF-C和MMP-2蛋白表达无显著性差异(P>0.05)。结论：1、研究发现,与正常胃组织相比,CXCR4/CXCL12在胃癌组织中高表达；随着胃癌的发生、进展和转移,CXCR4的表达逐渐上调,提示CXCR4在胃癌细胞中的阳性表达可能促进胃癌的发生、增殖、生长及转移。CXCR4/CXCL12过度表达的胃癌细胞具有更强的侵袭性和转移性,该生物轴也很可能成为协同胃癌进展、侵袭、转移并提示预后不良的一对重要的分子标志物。胃癌细胞株SGC7901能够高表达CXCR4,可以作为进一步细胞及分子领域研究的实验对象。2、成功构建CXCR4-shRNA腺病毒表达载体并筛选出沉默效率最高的一组。3、成功将CXCR4-shRNA重组腺病毒载体转染至胃癌细胞SGC7901并证明重组腺病毒载体CXCR4-shRNA可抑制胃癌细胞SGC7901中CXCR4基因的mRNA和蛋白的表达。4、重组腺病毒载体CXCR4-shRNA能显著抑制胃癌细胞SGC7901的增殖。5、重组腺病毒载体CXCR4-shRNA能降低胃癌细胞SGC7901的侵袭力。6、CXCR4-shRNA腺病毒载体可以有效地抑制原位移植瘤裸鼠腹水的产生,抑制肿瘤的生长,降低肿瘤的体积及重量,抑制胃癌细胞向各个腹腔脏器的转移；同时显著延长裸鼠的生存时间,降低死亡率。CXCR4-shRNA腺病毒载体下调CXCR4表达后,VEGF-C、MMP-2蛋白的表达下降,胃癌组织的生长、转移受到抑制。VEGF-C、MMP-2表达下调可能是CXCR4-shRNA腺病毒载体抑制胃癌生长转移的机制之一。