研究背景随着现代工业、交通的飞速发展,各种外伤引起的骨缺损日益增多,另外骨肿瘤、感染以及畸形等疾病的治疗也需要植骨或骨替代物治疗。目前,自体骨移植仍是临床最常用的方法,但供体的有限性及供骨区的相关并发症限制了其应用,并且增加了患者的痛苦。而异体骨具有较大的抗原性,特别是大型骨缺损需要较多骨量修复时,常因剧烈的免疫排斥反应导致植骨失败,且异体骨来源有限,尚存在潜在的疾病传播、医学伦理等问题,临床应用因而受到了限制。为了克服自体骨以及异体骨应用的诸多缺点和不利条件,寻找和开发能够替代自然骨的人工骨修复材料越来越成为日益迫切的要求。骨组织工程为当今骨科研究的热点。组织工程是应用工程学和生命科学的原理和方法,将种子细胞、特定组织的细胞因子与生物载体支架材料复合后进行培养,形成新的功能组织,来恢复和替代损伤组织的功能。这一概念是在1987年由美国国家科学基金会(NationalScienee Foundation, NsF)首次提出。1995年,Crane等在此基础上进一步系统地提出骨组织工程的科学意义、研究方法、研究现状和前景,引起了人们对骨组织工程研究领域的普遍关注。国际材料学会1996年秋季会议指出,骨组织工程应用的战略可分为两种：(1)将支架材料与细胞因子在体外组装后植入体内,诱导新骨形成；(2)将成骨细胞在体外种植于材料后植入体内。骨生长因子的研究一直是骨组织工程领域最热门的课题之一。外源性生长因子因其能显著促进效应细胞的增殖和分化、延缓细胞衰老、实现缺损组织修复再生,但体内直接应用生长因子,会很快被稀释代谢或酶的作用而失活。近年来不断有学者进行负载活性生长因子缓释载体的研究,从传统载体到各种载药微球载体,使生长因子的缓释时间不断延长,适用范围越来越广。随着控释给药、靶向给药等新技术的不断发展,活性生长因子的缓释的研究正受到越来越广泛的重视和关注。将纳米控释系统应用于活性生长因子的缓释,为外源性生长因子的开发与利用开辟了新的研究空间,成为组织工程领域的一个重要研究方向。特别是近年来纳米级微球控释技术的发展和人工可降解材料及其复合材料的不断涌现,为组织工程化人工骨的研发提供了前所未有的机遇和条件。骨形态发生蛋白(bone morphogenetrc proteins,BMP)是目前研究最充分、成骨活性最肯定的骨生长因子,美国食品和药物管理局(Food and Drug administration FDA)也于2002年7月批准重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)应用于脊柱融合。rhBMP-2等外源性生长因子稳定性不好、体内半衰期短、生物膜透过性差,应用微球系统控制释放多肽是解决缓释的方法之一。高分子药物缓释载体分为合成高分子(聚乳酸、聚己内酯、聚丙烯酸酯等)和天然高分子(明胶、纤维素、壳聚糖等)。合成高分子载体常常生物相容性不好,有时还因有毒物残留、降解等作用产生毒性杂质等,例如在聚乳酸的一般生产方法中使用了有机锡催化剂等,会产生细胞毒性。而天然高分子没有上述缺点,其中壳聚糖的研究最为备受关注,这是因为壳聚糖作为为甲壳素脱乙酰基产物,是天然多糖中唯一的碱性多糖,在自然界广泛存在,取材便利,生物相容性良好,可生物降解且降解产物无毒性,而且具有抗菌、止血、抑制癌细胞转移等作用。壳聚糖微球作为药物载体较其他材料制作的微球具有较明显的优势：(1)壳微糖微球表面有丰富的功能基团,可通过吸附或包裹两种方式灵活运载不同特性药物,这是其它微球载体所不能达到的功能；(2)壳微糖微球粘附性较好,在口、鼻、胃肠等粘膜给药时,特别是投递抗原和佐剂,具有其独特的优势；(3)壳聚糖微球表面有丰富的多糖链,能被某些特异性细胞(或组织)所识别,可靶向性投递药物至病灶部位贮存释放；(4)壳聚糖分子能作用于细胞间F-肌动蛋白,打开细胞通道,有利于提高药物在细胞间瞬间渗透的能力。因此,自20世纪90年代以来,壳聚糖微球载体在药物新剂型中的研究,已成为该领域研究的热点。壳聚糖微球在组织工程中,也可用于细菌培养与控释生长因子等。Jong等用乳化法交联制备TGF-β1壳聚糖微球,将其软骨细胞一同置入多孔的胶原-壳聚糖骨架中,体外培养3d后,其软骨细胞与粘多糖的量明显高于TGF-1的溶液组。说明TGF-1壳聚糖微球更有利于软骨细胞的形成。综上所述,壳聚糖作为理想的药物赋形剂,其微球与纳米粒作为各类药物的缓控释与靶向载体的研究,已在世界范围广泛展开。目前关于载骨生长因子壳聚糖微球的研究主要集中在载药微球本身的性质、释放规律及其对体外培养效应细胞的诱导及分化上,微球大小大多为微米级,而关于纳米级载骨生长因子的壳聚糖微球研究较少,且进一步将载药微球复合至人工骨并研究其成骨活性的研究少之又少,故本课题具有一定的创新性及研究意义。研究目的1、利用离子交联法制备出粒径为纳米级的负载重组人骨形态发生蛋白-2的壳聚糖微球,对载药微球理化特性进行研究,通过研究其载药率、包封率及缓释动力学等,分析其药理特性。2、采用国家标准中的植入材料的生物安全性评估实验——体外细胞毒性性实验来评估重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球的生物安全性,为进一步的成骨活性研究奠定基础。3、体外培养大鼠骨髓基质干细胞,并将重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球加入培养体系,与加入相同剂量的单纯重组人骨形态发生蛋白-2对比,分析载药微球对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞的诱导及分化作用,评估载药微球在体外对效应细胞的成骨诱导活性。4、行大鼠大腿肌袋异位成骨实验,重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球组与单纯植入同剂量的重组人骨形态发生蛋白-2对比,评估重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球的体内异位骨诱导活性。5、将重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球与珊瑚羟基磷灰石(Coralline hydroxyapatite, CHA)复合,制备新型复合重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球的CHA复合人工骨,植入大鼠脊柱融合模型中,研究其骨诱导效应。研究方法1、采用离子交联法制备重组人骨形态发生蛋白-2的壳聚糖纳米微球,行载药微球的电镜观察、激光粒径分析、降解性能、检测载药率、包封率并描述其缓释药动学。2、体外复苏、传代培养小鼠成纤维细胞,按国家标准中植入材料的生物安全性评估实验行重组人骨形态发生蛋白-2的壳聚糖纳米微球及空白微球的细胞毒实验,设阴性及阳性对照组,评估其生物安全性。3、体外行SD大鼠的骨髓基质干细胞的传代培养,加入重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球及同剂量的单纯重组人骨形态发生蛋白-2,通过MTT检测法及碱性磷酸酶活性分析,研究体外重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球对骨髓基质干细胞的增殖和分化作用。4、将重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球与同剂量的单纯重组人骨形态发生蛋白-2冻干粉植入SD大鼠大腿肌袋中,4周后大体观察、X线检查、组织学检查、碱性磷酸酶活性分析、钙含量测定,与植入单纯同剂量的重组人骨形态发生蛋白-2对比并评估载药微球的异位成骨活性。5、利用低温负压冻干法将载药微球与CHA人工骨复合制备重组人骨形态发生蛋白-2的壳聚糖纳米微球CHA人工骨,建立大鼠后外侧横突间脊柱融合模型,并将复合人工骨用于该模型。通过CT扫描、三维重建以及手法触诊等检查融合率情况,对有融合的大鼠进行取材并行病理切片检查等研究复合人工骨在体内的成骨活性。结果1、离子交联法成功制备出负载重组人骨形态发生蛋白-2的纳米级壳聚糖微球,微球的成球性良好、形态规整、分散均匀,平均粒径为230nm,包封率为(66.867±4.575)%,载药率为33.437±2.290μg/mg,45d时降解率为(57.567±2.759)%,释放为双相动力学,初相为突释相,后为缓释相,可继续释放重组人骨形态发生蛋白-2达30d,第30d释放率为(90.133±3.564)%。2、经小鼠成纤维细胞的细胞毒实验,空白壳聚糖纳米微球及重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球组三种不同浓度浸提液反应等级为0或1级,均为合格。阴性对照为0级,阳性对照为5级。3、成功在体外行SD大鼠的骨髓基质干细胞的传代培养,MTT检测法及碱性磷酸酶活性分析等提示重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球可明显促进骨髓基质干细胞的增殖和分化,且活性较单纯重组人骨形态发生蛋白-2组为强,差异有统计学意义(P<0.05)。4、植入SD大鼠大腿肌袋中4周后,重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球组及单纯重组人骨形态发生蛋白-2组均成功诱导出异位骨组织,但载药微球组较单纯植入同剂量的单纯重组人骨形态发生蛋白-2异位成骨量多,碱性磷酸酶及钙含量差异有统计学意义(P<0.05),而空白微球组及阴性对照组无明显成骨。5、将复合重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球的羟基磷灰石人工骨植入SD大鼠右侧横突间融合模型,4周时复合rhBMP-2壳聚糖纳米微球的CHA人工骨组及复合rhBMP-2的CHA人工骨组全部融合,均获得了100%的融合率,但复合rhBMP-2壳聚糖纳米微球的CHA人工骨组的ALP活性及钙含量较复合rhBMP-2的CHA人工骨组高,差异有统计学意义(P<0.05),而羟基磷灰石人工骨组及阴性对照组未融合。结论1、采用离子交联法制备工艺制备的壳聚糖纳米微球可作为单纯重组人骨形态发生蛋白-2的良好载体,工艺简便易行,载体外形及稳定性好,载药率及包封率较好,并具有良好的释药及降解等特性,这为重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球进一步应用于骨组织工程修复骨缺损提供了一种新方法和新思路。2、重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球体外细胞毒性试验采用了医用有机硅材料生物学评价的国家标准,方法简单,结果准确,对植入材料的生物相容性有重要的参考意义。结果表明空白壳聚糖纳米微球及重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球反应分级均为0-1级,即为合格,故重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球可作为一种较安全的植入材料进行进一步的骨组织工程实验。3、重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球与SD大鼠的骨髓基质干细胞的体外共培养结果提示重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球可明显促进骨髓基质干细胞的增殖和分化,且诱导活性强于单纯重组人骨形态发生蛋白-2组,故重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球在体外的对效应细胞的成骨活性良好,可作为骨生长因子载体继续进行进一步体内成骨活性研究。4、SD大鼠的大腿肌袋植入实验证实了重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球组及单纯单纯重组人骨形态发生蛋白-2组均可成功诱导出异位骨组织,但载药微球组较单纯植入同剂量的单纯重组人骨形态发生蛋白-2异位成骨活性更强,空白微球组及阴性对照组无明显成骨,可见重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球的在大鼠体内的缓释效果良好,故同剂量的重组人骨形态发生蛋白-2在载药微球组可表现出更强大的异位骨诱导活性。5、SD大鼠脊柱融合实验显示出复合重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球的羟基磷灰石人工骨具有很好的融合效果,表明重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球与羟基磷灰石人工骨复合后可继续发挥其缓释效应,提高骨诱导活性,也为进一步大动物研究及临床应用奠定了坚实的实验基础和理论依据。