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前言:溶质载体（SLC,Solute Carrier）家族是体内最大的转运体家族,SLC4是其中负责体内碳酸氢盐转运最重要的亚家族。NBCe1是SLC4家族的重要成员之一,由SLC4A4基因编码,主要在肾近端小管基底外侧膜表达。NBCe1在肾小管HCO3-重吸收过程中发挥至关重要的作用。NBCe1的功能异常会导致严重的HCO3-重吸收障碍,引起肾小管酸中毒,其特征为血液中的HCO3-浓度偏低,pH值下降。有报道显示,NBCe1的突变不仅使患者血液pH值偏低,表现为严重的酸中毒,还表现为身材矮小、白内障以及偏头痛、智力障碍等异常;还有研究表明,NBCe1基因敲除鼠同样表现出非常严重的肾小管酸中毒症状及其他异常。可见NBCe1具有十分重要的生理功能,其异常严重影响人类健康。因此研究NBCe1表达调控具有重要意义,而目前相关研究报道甚少。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,发生泛素化修饰的蛋白可被26S蛋白酶体识别并降解,可见泛素化修饰对蛋白表达具有重要的调控作用。泛素E3连接酶可特异性识别靶蛋白,在泛素化修饰过程中发挥关键性作用。作为Nedd4家族的一个重要成员,Nedd4-2是一种重要的泛素E3连接酶。研究已证实,肾脏中ENaC、NCC和NKCC2等关键的离子通道蛋白均为Nedd4-2的靶蛋白。其中,研究最为清楚的是ENaC。Nedd4-2通过介导上述蛋白的泛素化修饰,影响其蛋白表达,在水电解质平衡调节中发挥关键性作用。但是作为一种重要的泛素E3连接酶,Nedd4-2的功能远不止于此。因此,鉴定新的Nedd4-2靶蛋白将有助于发现Nedd4-2在肾脏中新的功能。我们通过生物信息学预测发现:NBCe1的蛋白序列中存在可与Nedd4-2相互作用的序列;同时,我们在UbiBrowser网站上搜索NBCe1的泛素E3连接酶,排名和置信度最高的都是Nedd4-2。基于这些证据,我们推测Nedd4-2可能与NBCe1相互作用,并作为其E3连接酶介导其泛素化和降解。另外值得关注的是,作为泛素E3连接酶,Nedd4-2本身的活性和表达调控将对其功能具有重要影响,而关于其调控的机制目前尚不清楚。Neddylation修饰是一种类泛素化修饰,由三种Nedd8特异性酶的级联反应介导。研究表明,HECT家族的泛素E3连接酶Smurf1和Smurf2会发生Neddylation修饰,Neddylation修饰可能通过调控泛素E3连接酶的活性,进而影响下游靶蛋白的泛素化水平。由于Nedd4-2也含有HECT结构域,我们推测Nedd4-2也可能发生Neddylation修饰,通过预实验发现Nedd4-2与Nedd8存在相互作用,支持我们的上述推测。因此,我们推测Neddylation修饰可通过激活Nedd4-2,进而影响靶蛋白NBCe1的泛素化修饰及其蛋白表达水平。为证实该假设,本课题将首先研究Nedd4-2对NBCe1的调控及其机制。在此基础上,进一步研究Neddylation修饰是否可通过Nedd4-2来调控NBCe1的蛋白水平。本研究将发现一个新的调控途径:即Neddylation修饰介导的Nedd4-2激活,使靶蛋白NBCe1的泛素化水平增加导致其蛋白水平降低。该途径的证实将为肾脏酸碱平衡调节的深入研究提供重要的科学依据,也将为相关疾病的药物研发提供新的靶点。材料与方法:1、实验材料:小鼠肾脏M1细胞系、重组蛋白GST-Nedd4-2,His-NBCe1、条件性基因敲除小鼠Nedd4-2fl/fl;Ksp1.3（C57B6J）,体外泛素化试剂盒,体外Neddylation试剂盒,NBCe1、Nedd4-2、Nedd8表达载体,Nedd4-2 sh RNA载体、相关抗体等。2、实验方法:细胞培养、基因瞬时转染、实时定量荧光PCR、Western Blot检测、免疫共沉淀实验、蛋白纯化实验、GST-Pulldown实验、体外泛素化实验、体外Neddylation实验及统计分析等。结果:1、Co-IP实验结果显示,Nedd4-2可与NBCe1相互作用,而NBCe1又可与泛素相互作用;GST-Pulldown实验结果显示,Nedd4-2与NBCe1存在直接的相互作用。体内体外实验均提示Nedd4-2可与NBCe1相互作用并介导NBCe1泛素化修饰。2、蛋白酶体抑制剂MG132刺激M1细胞后,Western Blot检测结果表明NBCe1表达显著上调（P<0.05）,说明NBCe1可能受到泛素化修饰调节。体外泛素化实验结果进一步证明Nedd4-2可作为E3连接酶在体外介导其泛素化修饰。3、在小鼠肾脏M1细胞中过表达Nedd4-2后,Western Blot结果显示,与对照组相比,NBCe1的表达水平显著降低（P<0.05）,MG132处理可回复Nedd4-2过表达所致的NBCe1表达降低（P<0.05）;敲低Nedd4-2使NBCe1表达水平显著增高（P<0.05）。4、在M1细胞中过表达Nedd4-2后,Western Blot结果显示,与对照组相比,M1细胞胞膜NBCe1蛋白的表达水平降低（P<0.05）,而胞质NBCe1蛋白的表达水平显著增高（P<0.05）。5、分别提取Nedd4-2敲除鼠与对照组小鼠肾脏总蛋白进行Western Blot实验,结果表明:与对照组Nedd4-2fl/fl小鼠相比,Nedd4-2fl/fl;Ksp1.3小鼠肾脏中NBCe1的表达显著增高（P<0.05）,这与细胞水平敲低Nedd4-2后的结果一致。6、通过Co-IP实验检测NBCe1的泛素化水平,结果表明:与对照组Nedd4-2fl/+;Ksp1.3和Ksp1.3-Cre小鼠相比,Nedd4-2fl/fl;Ksp1.3小鼠肾脏中NBCe1的泛素化修饰水平下调。7、提取小鼠肾脏M1细胞的总蛋白进行Co-IP实验,结果显示,Nedd4-2与Nedd8存在相互作用。体外Neddylation实验结果显示,Nedd8可以与Nedd4-2发生直接的相互作用;与对照组相比,Nedd8与Nedd4-2的结合能力明显增强。8、实时定量荧光PCR结果显示,小鼠肾脏M1细胞中过表达Nedd8后,NBCe1mRNA表达水平与对照组相比无显著差异。9、Western Blot实验结果显示,过表达Nedd8后,M1细胞中NBCe1的蛋白表达水平显著下调（P<0.05）,作为阳性对照的ENaC表达水平也显著下调（P<0.05）;Nedd4-2干扰载体可回复Nedd8表达载体所致的NBCe1及ENa C表达水平下调（P<0.05）。10、Western Blot实验结果显示,Neddylation E1（NAE）抑制剂MLN4924刺激M1细胞后,NBCe1的表达水平显著增高（P<0.05）,ENa C表达水平也显著增高（P<0.05）。结论:1、Nedd4-2是NBCe1的泛素E3连接酶,并介导其发生泛素化修饰和降解。2、Nedd4-2fl/fl;Ksp1.3敲除鼠肾脏中NBCe1表达显著上调,NBCe1的泛素化修饰水平下调。3、Nedd4-2可发生Neddylation修饰,Neddylation修饰可激活Nedd4-2进而调节NBCe1的降解。