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研究背景胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)是成人中枢神经系统中侵袭性最高的原发恶性肿瘤,发病率约占所有胶质瘤的54%。目前的胶质母细胞瘤主要治疗手段是手术辅以术后放疗和化疗的综合性治疗方法,尽管近年来科学工作者在胶质母细胞瘤临床和基础的研究以及综合治疗方法上取得了一定的进步和改善,但胶质母细胞瘤总体疗效仍欠佳,预后极差,约88%的胶质母细胞瘤患者5年生存率不足5%,总体中位生存期仅有约14个月。因此,更加有效的治疗手段亟待被研究来改善胶质母细胞瘤的治疗现状。上皮膜蛋白 1(Epithelial membrane protein 1,EMP1)是 EMP 家族的成员,其在质膜上被认为是一种细胞连接蛋白,然而,EMP1在细胞中的确切功能与作用并不清楚。近年来,已有科学家指出EMP家族的几个成员广泛参与多种癌症进展。研究证实,EMP1参与肺癌细胞吉非替尼耐药;在儿科白血病和胃癌中,EMP1通过调节肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,已被证明是一种新的肿瘤不良预后因子。在胶质母细胞瘤中,EMP1也被发现与癌症相关因子MYC有相互作用。然而,EMP1在胶质母细胞瘤中的生物学意义和作用仍不清楚。在本研究中,我们研究了 EMP1在恶性胶质瘤中的临床意义和潜在功能。基于TCGA、Rembrandt和CGGA人脑胶质瘤数据库,我们发现EMP1表达增加与肿瘤分级增加以及患者预后差异明显相关(P<0.001)。体外实验中,敲减U87MG和P3GBM(人胶质瘤母细胞瘤原代细胞)细胞中EMP1基因可以显著抑制肿瘤的增殖和侵袭能力。此外,我们发现PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活是EMP1促进的胶质瘤恶性进展的机制通路。最后,我们通过使用颅内原位胶质母细胞瘤动物模型证明,EMP1敲减显著抑制体内肿瘤生长并增加荷瘤小鼠的总体存活率。我们的研究揭示了 EMP1介导胶质母细胞瘤细胞增殖、侵袭的分子机制,并提出了靶向EMP1诊疗胶质母细胞瘤的可能性。第一部分EMP1在胶质瘤中的表达及其与胶质瘤患者预后的关系目的探究EMP1基因在人正常脑组织、人各个级别胶质瘤中的表达及其与预后的关系。方法1.通过 Oncomine、TCGA、REMBRANDT 和 CGGA 数据库,探究 EMP1 基因表达与胶质瘤级别的相互关系。2.收集人正常脑组织、人各个级别胶质瘤标本并制作石蜡切片,通过免疫组化探究EMP1基因表达与胶质瘤级别的相互关系。3.收集人正常脑组织、人各个级别胶质瘤标本并提取组织标本蛋白。应用Western blot探究EMP1基因表达与胶质瘤级别的相互关系。4.通过TCGA、REMBRANDT和CGGA数据库,探究EMP1基因表达与胶质瘤患者预后的相互关系。结果1.胶质瘤中EMP1基因表达较正常脑组织明显上调。1.1通过meta分析方法探究Oncomine数据库中人胶质瘤数据(Lee Brain 2006,Murat Brain 2008,Shai Brain 2003,Sun Brain 2006,TCGA Brain 2013),我们发现胶质瘤中EMP1基因表达较正常脑组织明显上调。1.2通过分析TCGA、REMBRANDT和CGGA5数据库中人胶质瘤数据,我们发现胶质瘤中EMP1基因表达较正常脑组织明显上调,且随着胶质瘤级别的增高,EMP1基因表达量上调。1.3运用免疫组化技术分析本单位标本库中胶质瘤标本,我们发现胶质瘤中EMP1基因表达较正常脑组织明显上调,且随着胶质瘤级别的增高,EMP1基因表达量上调。1.4运用Western blot技术检测本单位标本库中胶质瘤组织蛋白,我们发现胶质瘤中EMP1基因表达较正常脑组织明显上调,且随着胶质瘤级别的增高,EMP1基因表达量上调。2.胶质瘤中EMP1基因表达与胶质瘤患者不良预后相关。通过分析TCGA、REMBRANDT和CGGA5数据库中人胶质瘤数据,我们发现胶质瘤中EMP1基因表达与胶质瘤患者不良预后相关。结论EMP1表达水平与胶质瘤恶性程度正相关,且EMP1高表达可作为胶质瘤患者预后不良的独立因素,可用于胶质瘤患者临床诊疗和预后评估。第二部分EMP1通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进胶质母细胞瘤恶性行为目的探究EMP1对胶质母细胞瘤细胞恶性行为的影响及分子机制。方法1.通过生信分析方法分析TCGA人胶质瘤数据库中与EMP1高度正、负相关的基因。进一步对与EMP1高度正、负相关的基因进行功能富集分析和参与信号通路分析。2.应用Western blot探究人正常星形胶质细胞Astrocyte和胶质母细胞瘤细胞系P3 GBM、T98、A172、U87MG 和 U251 中 EMP1 的表达。3.使用慢病毒转染(sh-NC和sh-EMP1)并敲减U87MG和P3 GBM中EMP1的基因表达,并应用Western blot检测EMP1敲减效率。4.应用CCK-8法探究sh-NC和sh-EMP1组细胞活性的变化。5.应用细胞划痕实验探究sh-NC和sh-EMP1组细胞迁移能力的变化。6.应用Transwell实验方法探究sh-NC和sh-EMP1组细胞侵袭能力的变化。7.应用Western blot探究sh-NC和sh-EMP1组PI3K-AKT信号通路相关基因AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白表达水平的影响。8.使用AKT增强剂SC79后,应用Western blot探究sh-NC和sh-EMP1组PI3K-AKT信号通路相关基因AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白表达水平的影响。9.使用AKT增强剂SC79后,应用CCK-8法探究sh-NC和sh-EMP1组细胞活性的变化。10.使用AKT增强剂SC79后,应用Transwell实验方法探究sh-NC和sh-EMP1组细胞侵袭能力的变化。1 1.应用立体定向仪将luciferase-stable sh-NC和sh-EMP1 P3 GBM细胞种入4周龄裸鼠颅内,应用小动物成像仪在第2周和第4周监测裸鼠颅内肿瘤生长情况。12.每天监测裸鼠体重,体重下降≥20%时麻醉裸鼠,灌注4%多聚甲醛后取脑。脑分别做冰冻切片和石蜡切片。13.应用免疫组化Ki67、MMP2和MMP9染色法探究EMP1对胶质母细胞瘤体内增殖和侵袭能力的影响。结果1.生物信息学方法预测EMP1在胶质瘤中的潜在生物学功能及信号通路调控。1.1 TCGA数据库人脑胶质瘤中与EMP1共表达的基因GO分析示参与细胞凋亡、细胞增殖和细胞外基质重组等过程。1.2 TCGA数据库人脑胶质瘤中与EMP1共表达的基因KEGG分析示PI3K-AKT和MAPK信号通路可能参与EMP1调节胶质瘤行为的过程。2.敲减EMP1抑制胶质母细胞瘤增殖、迁移和侵袭能力。2.1 Western blot结果显示,与人正常星形胶质细胞(Normal Human Astrocyte)NHA比,胶质母细胞瘤EMP1蛋白表达水平增多,以P3 GBM和U87MG最为显著。2.2 Western blot示通过慢病毒质粒在U87MG和P3 GBM蛋白水平敲减EMP1。2.3 CCK-8结果显示,敲减EMP1后,U87MG和P3 GBM的细胞活性较敲减对照组明显下降。2.4细胞划痕实验结果示,敲减EMP1后,U87MG和P3 GBM的细胞迁移能力较敲减对照组明显下降。2.5 Transwell实验结果示,敲减EMP1后,U87MG和P3 GBM的细胞侵袭能力较敲减对照组明显下降。3.EMP1通过PI3K/AKT/m TOR信号通路促进胶质母细胞瘤恶性行为。3.1 Western blot结果显示,敲减EMP1后,胶质母细胞瘤AKT/mTOR信号通路被明显抑制。3.2使用AKT增强剂SC79后,敲减EMP1不能明显抑制胶质母细胞瘤细胞活性。3.3使用AKT增强剂SC79后,敲减EMP1不能明显抑制胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力。4.敲减EMP1抑制胶质母细胞瘤的体内生长并延长荷瘤裸鼠生存期。4.1小动物成像结果显示,sh-EMP1组较sh-NC组裸鼠颅内胶质母细胞瘤体积减小。4.2裸鼠Kaplan-Meier生存曲线示sh-EMP 1组较sh-NC组荷胶质母细胞瘤裸鼠生存期延长。5.敲减EMP1抑制胶质母细胞瘤细胞的体内增殖和侵袭能力。5.1免疫组化结果示sh-EMP1组较sh-NC组胶质母细胞瘤肿瘤组织细胞增殖标志物Ki67 阳性细胞减少。5.2免疫组化结果示sh-EMP 1组较sh-NC组胶质母细胞瘤肿瘤组织细胞侵袭标志物MMP2和MMP9阳性细胞减少。结论1.EMP1通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进胶质母细胞瘤恶性行为。2.敲减EMP1可以明显抑制胶质母细胞瘤的体内生长并延长荷瘤裸鼠生存期。