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新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是一种有囊膜,含有单股负链、不分节段基因组的RNA病毒,其基因组结构为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’,至少编码六种结构蛋白。基质蛋白（matrix protein,M）是NDV M基因编码的一种分子量为40 kD,位于病毒囊膜内侧且高度碱性的疏水性蛋白。与大多数副黏病毒M蛋白一样,NDV M蛋白也是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白,即在病毒感染早期M蛋白通过自身携带的核定位信号（nuclear localization signal,NLS）与importinβ1相互作用并且以RanGTP依赖的方式进入细胞核,而在感染后期M蛋白则通过三个核输出信号以CRM1非依赖的方式进入细胞质。细胞基质蛋白3（matrin 3,MATR3）是最早报道的12种主要核基质蛋白之一,主要定位在细胞核,在不同的细胞类型中广泛表达且高度保守。MATR3蛋白与转录调节、mRNA前体剪接和稳定性、DNA损伤修复和细胞增殖等功能密切相关,并且还参与调控病毒RNA的核输出、病毒基因组的稳定性和表达。本课题组前期利用酵母双杂交系统从鸡胚成纤维细胞cDNA文库中筛选到NDV M蛋白和鸡MATR3蛋白存在相互作用,但是这种互作在NDV复制中的作用尚不清楚。本研究首先对鸡MATR3基因进行克隆和生物信息学分析,鉴定介导MATR3蛋白细胞核定位的核定位信号,然后构建M基因和MATR3基因真核表达载体,通过荧光共定位和免疫共沉淀技术验证M蛋白和MATR3蛋白之间的相互作用,最后利用RNA干扰技术干扰BSR-T7/5细胞中MATR3蛋白的表达,研究其对NDV复制的影响。1.鸡MATR3基因的克隆和生物信息学分析参照GenBank中登录的鸡MATR3基因序列（序列号:NM204147）,设计合成特异性引物,通过RT-PCR从DF-1细胞中扩增出鸡MATR3基因,并进行克隆和测序。利用生物信息学软件对其编码的蛋白质进行理化性质、二级结构和三级结构分析,预测其功能结构域,并绘制遗传进化树。结果表明,鸡MATR3基因ORF序列全长为2 709 bp,共编码902个氨基酸,理论pI为5.79,分子质量约为100.71 kDa,分子式可表示为C4362H6903N1267O1418S29;二级结构预测可知鸡MATR3蛋白含有丰富的二级结构,以无规则卷曲（47.67%）和α-螺旋（33.81%）为主;功能结构域预测显示该蛋白有2个锌指结构域和2个RNA识别基序。核苷酸同源性及遗传进化分析表明鸡与火鸡亲缘关系最近。2.鸡MATR3蛋白核定位信号的预测与鉴定运用在线软件对鸡MATR3蛋白NLS进行预测;参照GenBank中登录的鸡MATR3基因序列,设计合成Overlap PCR引物,构建表达不同鸡MATR3蛋白缺失体的重组真核表达载体,转染细胞后通过观察亚细胞定位来确定鸡MATR3蛋白NLS结构域;进一步根据NLS邻近碱性氨基酸序列特征,构建NLS邻近氨基酸缺失的重组真核表达载体,观察NLS邻近碱性氨基酸是否也参与鸡MATR3蛋白的细胞核定位。结果表明,鸡MATR3蛋白存在4个假定NLS（putative NLS,pNLS）,只有pNLS2(596PSDKKSK602)缺失时才导致鸡MATR3蛋白丧失核定位特征。并且,鸡MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸不参与NLS介导的MATR3蛋白细胞核定位。此外,我们还发现该NLS基序在不同物种的MATR3蛋白中均保守,并且与SV40大T抗原NLS具有相同的核输入能力。3.鸡MATR3蛋白与NDV M蛋白相互作用的验证参照GenBank中登录的鸡MATR3基因序列和NDV SS1株M基因序列,分别设计合成特异性引物构建重组真核表达载体pDsRed-MATR3、pCMV-Myc-MATR3和pEGFP-M,将pDsRed-MATR3和pEGFP-M共转染细胞,观察鸡MATR3蛋白和M蛋白共定位情况;将pCMV-Myc-MATR3和pEGFP-M共转染细胞,利用免疫共沉淀方法鉴定鸡MATR3蛋白与M蛋白的相互作用。结果表明,EGFP-M和DsRed-MATR3融合蛋白均分布在细胞核,在细胞核中有明显的共定位;免疫共沉淀结果显示EGFP-M可与Myc-MATR3发生共沉淀,反之Myc-MATR3也可与EGFP-M发生共沉淀。以上结果表明,鸡MATR3蛋白和NDV M蛋白在细胞核中发生相互作用。4.干扰细胞中MATR3蛋白的表达对NDV复制的影响将MATR3 siRNA转染BSR-T7/5细胞,验证siRNA对细胞中MATR3蛋白表达的影响,然后在siRNA转染细胞后36 h感染1 MOI的NDV,观察不同时间点的细胞病变情况并测定细胞上清的病毒滴度,同时用荧光定量PCR方法检测病毒感染细胞24 h后细胞沉淀和细胞上清中NDV M基因mRNA的表达水平。结果表明,病毒感染细胞24 h后出现明显的细胞病变,病毒滴度在36 h达到最大值;MATR3 siRNA组细胞病变和病毒滴度均低于Control siRNA组和Normal组。同时,MATR3 siRNA组NDV M基因表达水平低于Control siRNA组和Normal组。以上结果表明,干扰细胞中MATR3蛋白的表达抑制了病毒的复制。