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杆状病毒（Baculovirus）是鳞翅目昆虫重要的病原微生物，在重要农业害虫的生物防治中具有很大的应用价值。对棉铃虫核型多角体病毒基因的深入研究有助于详细了解相关结构基因或复制基因等在杆状病毒生活史中的功能以便对病毒进行改造。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）是细胞体内歧化超氧阴离子自由基（O2-）的一个抗氧化酶，在生物代谢过程中起着十分重要的作用。本文用PCR方法从棉铃虫（Helicoverpa armigera）单粒包埋型核型多角体病毒（HaSNPV）C1株基因组中扩增sod基因编码区，克隆到pGEM-T Easy Vector，测定了目的基因核苷酸序列。对HaSNPV sod基因核苷酸序列进行了分析，并用Genetyx软件比较了15种杆状病毒SOD氨基酸序列同源性，利用UPGMA和NJ软件建立分子进化树进行分子进化关系比较，在此基础上分别在大肠杆菌和昆虫细胞中表达了棉铃虫核型多角体病毒超氧化物歧化酶。本研究主要结果分为三部分： 1 HaSNPV C1 sod基因序列分析 根据已经报道的HaSNPV C1基因组序列，sod基因编码区位于以多角体蛋白基因翻译开始密码子（ATG）为原点的基因组的100,487-100,966 bp处，转录方向与多角体蛋白基因一致。根据该核苷酸序列设计引物，从基因组中PCR扩增目的基因片段，PCR产物测序结果表明与已经报道的HaSNPV Clsod基因序列完全一致。目的基因编码区片段大小为480bp，推测编码的多肽为159个氨基酸残基，G+C含量为48.13％，推测其蛋白分子量为16.8kDa。在翻译开始密码子ATG上游-18处有典型的杆状病毒晚期基因转录起点motif ATAAG。用Genetyx软件将推导的HaSNPV C1 SOD氨基酸序列与目前已报道的其它15种杆状病毒和人Cu／Zn-SOD进行联配和同源性分析的结果表明，与HzSNPV的同源性高达98.7％，与其他与核型多角体病毒（NPV）SOD氨基酸序列同源性均在69.1％以上，与PoGV等5种颗粒体病毒（GV）的SOD同源性为53.0％-62.4％。HaSNPV SOD与人Cu／Zn-SOD（SOD1）氨基酸序列同源性也高达49％。HaSNPV的SOD存在类似于人的Cu／Zn-SOD的保守残基。Cu配位组氨酸残基分别位于His40、His43、His60、His118，Zn配位组氨酸残基则分别位于His60、His68、His77、Asp80。HaSNPV SOD的其他保守的关键残基如Arg141，对酶的活性是关键的。Cys54和Cys144是亚基形成二硫键所必需的，21-26个Gly中有18个Gly残基对多肽骨架大幅度弯曲也起重要作用。根据氨基酸序列的同源性和motif的保守性，可以确定HaSNPV的SOD是一种Cu／Zn-SOD。利用UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）和NJ（neighbor-joining method）绘制的杆状病毒和人Cu／Zn-SOD的分子进化关系表明NPV和GV的SOD各自形成一个分支，人的SOD形成另一分支，HaSNPV与HzSNPV SOD的亲缘关系最为接近，与AcMNPV、BmNPV、RoMNPV的SOD也有较接近的亲缘关系。 浙江人学硕卜学位论义 学叶2(＊16（MS2 HaSNPV CI sod基因在大肠杆菌里的表达 用PCR方法从棉铃虫什拒icoverpa armigera）单粒包埋型核型多角体病毒 （HaSNPV）CI株基因组中扩增 sod基因编码区，克隆到 pGEM1 Easy Vector，测定了核苦酸序列。将基因编码区克隆到原核表达载体pETBlueZ，构建了重组表达质粒 PETBlueZ／HaSNPV SOD，转化大肠杆菌 DE3（BLZI）进行 IPTG诱导表达。SDS－PAGE分析表明SOD的表达量约为细胞总蛋白的37％。邻苯三酚法测定表达蛋白活性，结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白中表达产物校正酶活力单位为 694 U／mg O3以杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达 HaSNPV CI sod基因 将目的基因 HaSNPV CI sod克隆到转移载体 pBacHTeGFP，启动子为加基因启动子。在启动子和目的基因之间依次为有利于纯化和鉴定的 His tag及绿色荧光蛋白基因。利用重组的转移载体pBaCHTeGFP侣OD转化带有穿梭载体BaCmid和辅助质粒的感受态DH10菌，提取重组病毒DNA，PCR鉴定。取重组杆状病毒Bacmid－SOD的基因组DNA，用于转染粉纹夜蛾细胞Tn巧。在无血清条件下用Lipofectin脂质体介导重组Bacmid—SOD DNA转染生长状态良好的粉纹夜蛾细胞，sh后换新鲜培养基（含 10％胎牛血清），72h后取川 yi含病毒粒于的培养液传代感染。连续 45次传代感染后，细胞感染症状明显，生长状态良好的细胞感染72h后细胞分裂停止、形状变为圆球状、大部分悬浮在培养液。荧光显微镜下检测可见感染重组病毒72h的细胞发出强烈的荧光，这表明融合蛋白己经在昆虫细胞中得到表达。邻苯三酚法测定表达蛋白生物活性，结果表明每毫升细胞可溶性总蛋白中表达产物校正酶活力单位为 109．48U／ml。