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肝细胞肝癌(Hepatocellliar carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,对人类的健康和生存构成了极大的危害。HCC是肝脏恶性肿瘤中最常见的一种,其发病率在东亚,东南亚及非洲等地区相对较高。目前关于这一恶性疾病的发病机理仍不清楚。大量研究表明在肝细胞肝癌的发生发展过程中,肝脏细胞往往会发生染色体缺失,扩增,基因突变等基因组改变。在我们前期研究中,通过单核苷酸多态性芯片(single nucleotide polymorphisms,SNP 6.0)分析肝细胞肝癌病人组织样本基因组,获得1241个拷贝数变异(copy number alterations,CNA)区域,其中包括多个新发现的拷贝数变异区域,例如14q31.1-32.13缺失区域和19p13.2扩增区域。本研究着重鉴定及分析了位于这两个新的拷贝数变异区域中的肿瘤相关基因。首先,通过整合性分析拷贝数变异与表达谱芯片结果,在14q31.1-32.13这一区域中得到六个候选基因。在大规模独立肝细胞肝癌组织样本中通过q-PCR检测,发现SERPINA5及SERPINA10基因在肝癌组织中显著下调,并且通过相关性分析发现SERPINA5及SERPINA10基因表达水平的下调部分是由于基因剂量下调引起。另外,SERPINA5基因的表达水平和肝癌样本的肿瘤分级和肝内转移呈负相关。通过体内外功能实验,发现SERPINA5基因能够抑制肝癌细胞的转移能力。并且,分泌至胞外的S ERPINA5蛋白和纯化的SERPINA5重组蛋白均能抑制肝癌细胞的体外迁移能力。通过免疫沉淀结合LC-MS/MS及GST pull down等实验,发现SERPINA5蛋白能够与细胞外基质蛋白纤连蛋白(Fibronectin)直接结合,进而干扰纤连蛋白-整合素β1信号通路,发挥其抑制肝癌细胞迁移的能力。另一方面,通过整合性分析拷贝数变异与表达谱芯片结果,在19p13.2这一拷贝数扩增区域中得到了SMARCA4基因。在大规模独立肝癌组织样本中通过q-PCR检测,发现SMARCA4基因在肝癌组织中显著上调。分析公共数据库(TCGA和Oncomine)的结果进一步确定SMARCA4基因在肝癌中发生显著上调并且和肿瘤组织病理分级呈正相关。通过体、内外实验,发现SMARCA4基因能够显著促进肝癌细胞的增殖能力。此外,通过细胞周期和细胞凋亡分析发现干扰SMARCA4基因能够引起肝癌细胞G1期阻滞和诱导细胞凋亡综上所述,本研究通过对肝癌基因组中新发现的两个拷贝数变异位点进行研究,发现2个新的肝癌相关基因,即SERPINA5及SMARCA4,为进一步阐明肝癌的发病机制提供了新的理论依据。第一部分 14q31.1-32.13拷贝数缺失区域中肿瘤相关基因鉴定我们前期研究中,在肝细胞肝癌基因组中发现一个新的高频拷贝数缺失区域,即14q31.1-32.13。为了进一步阐明这一区域在肝癌发生发展过程中所发挥的功能,本研究拟通过整合性分析方法,鉴定位于此区域中的候选肿瘤相关基因。首先,通过整合拷贝数变异与基因表达谱数据,发现6个下调基因位于此缺失区域中,即RIN3,KIAA1622,SERPINA3,SERPINA6,SERPINA5和SERPINA10。进一步通过q-PCR在125对HCC组织基因组DNA和130对HCC组织的mRNA中对6个下调基因进行独立样本验证。结果发现只有SERPINA5和SERPINA10基因无论在基因剂量还是表达水平上均发生一致下调。此外,通过相关性分析发现,基因剂量的降低均能够引起这2个基因表达水平下调。综上所述,本研究通过整合性分析拷贝数变异与基因表达谱数据,发现肝癌基因组中14q31.1-32.13位点的频繁拷贝数缺失能够引起SERPINA5及SERPINA10基因表达水平的下调。第二部分 SERPINA5基因在肝癌细胞中的功能研究本研究将着重研究SERPINA5基因的下调在肝癌中所发挥的生物学功能及临床意义。首先,通过Oncomine数据库分析进一步确定了SERPINA5基因在肝癌中表达水平显著下调。根据SERPINA5基因在肝癌组织中的相对表达水平,分析其与HCC组织的病理学指标之间的相关性,发现SERPINA5基因与HCC样本的肿瘤恶性程度和肝内转移这两个临床指标呈现负相关,提示其可能在肝癌的恶性进展过程中发挥重要作用。通过shRNA介导的干扰实验,发现在肝癌细胞中稳定干扰SERPINA5基因能够显著促进其体外迁移能力。另外,通过慢病毒介导的外源性过表达SERPINA5能够显著抑制肝癌细胞的体内和体外的转移能力。此外,由于SERPINA5是一个分泌型的蛋白,因此本研究分别收集了稳定表达和干扰SERPINA5基因的细胞株来源的条件培养基,并用于处理肝癌细胞,发现分泌到细胞外的SERPINA5蛋白亦能够显著抑制肝癌细胞的迁移能力。进一步,为了排除收集的条件培养基中所含其他因子的影响,利用纯化的SERPINA5重组蛋白处理细胞,结果显示SERPINA5重组蛋白对肝癌细胞的体外迁移能力具有直接显著的抑制作用,并具有浓度依赖特性。值得注意的是,本研究中发现SERPINA5基因对肝癌细胞的增殖没有明显的影响。综上所述,SERPINA5基因能够显著抑制肝癌细胞的体内外转移能力。第三部分 SERPINA5基因抑制肝癌细胞转移的机制研究本研究将着重阐明sERPINA5基因抑制肝癌细胞转移能力的机制。首先,通过免疫共沉淀结合蛋白质谱技术,我们将SERPINA5蛋白与肝癌细胞中的膜蛋白结合复合物进行了质谱鉴定,发现SERPINA5蛋白能够与细胞外基质蛋白纤连蛋白相互结合。另外,通过双向的免疫共沉淀实验,进一步确定SERPINA5蛋白和纤连蛋白之间的结合。此外,通过体外GST pull down实验,证明了二者之间能够直接结合。通过体外功能实验,发现在SERPINA5蛋白处理细胞同时外源性添加纤连蛋白能够部分回复细胞的迁移能力；而在干扰SERPINA5基因的细胞中干扰纤连蛋白基因,该细胞的迁移能力就不再呈现上升趋势。另外,SERPINA5蛋白处理肝癌细胞能够抑制该细胞在纤连蛋白包被的迁移实验小室上的迁移能力。由于整合素β1亚基是纤连蛋白的经典受体,本研究发现整合素β1信号通路中效应蛋白的磷酸化受到SERPINA5的影响,包括整合素β1及其下游的FAK.Src等蛋白的磷酸化水平。另外,干扰整合素β1基因的表达与干扰纤连蛋白基因具有相似的效应。综上所述,SERPINA5蛋白通过与纤连蛋白直接结合,从而破坏了纤连蛋白-整合素β1信号通路,来发挥对肝癌细胞转移的抑制作用。第四部分 拷贝数扩增区域19p13.2及其相关基因SMARCA4在肝癌细胞中的功能及作用机制研究在实验室前期关于肝癌基因组拷贝数变异相关研究过程中,发现了肝癌基因组中一个新的拷贝数扩增位点19p13.2。进一步研究发现这一扩增位点能够特异性引起SMARCA4基因的表达水平上调,提示该基因作为一个潜在的肿瘤相关基因在肝癌发生、发展过程中发挥重要作用。本课题将着重对SMARCA4基因在肝癌中生物学功能及作用机理进行深入研究,为阐明肝癌发病的分子机制及治疗提供理论依据。首先,应用生物信息学及q-PCR等实验方法发现SMARCA4基因在肝癌中显著上调并和肿瘤样本的恶性程度呈正相关。然后,通过体内、外实验发现SMARCA4基因能够显著促进肝癌细胞的增殖能力。另外,通过细胞周期分析发现干扰SMARCA4会导致肝癌细胞出现G1期阻滞现象和凋亡细胞的百分构成比上升。和前面结果一致,在体外过表达SMARCA4基因以后,出现细胞增殖能力的增强。因此,我们首次在肝癌细胞中证明了SMARCA4不仅是一个表达上调的基因,而且还是一个对肝癌细胞的增殖能力有显著促进的基因。