论文部分内容阅读
家蚕的解毒酶系是一类异质酶系,主要包括酯酶(主要是羧酸酯酶)和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、细胞色素P450和非专一性酯酶等,能够代谢大量的内源或外源底物。代谢抗性机制主要是通过解毒代谢酶基因扩增或过量表达,导致解毒代谢调节酶的活性显著升高,解毒代谢能力增强而形成抗性。因此家蚕解毒酶系的表达特性及相关基因的克隆与功能研究对阐明昆虫抗性的分子机理具有十分重要的意义。 本研究内容包括以下四个方面: (1)家蚕AChE和GST相关基因的克隆与鉴定。本文对农药具有抗性及敏感性家蚕体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)基因进行了基因扩增与克隆,根据AChE和GSTs基因翻译的氨基酸序列用同源模建方法和从头模建方法分析了抗性蚕品种与敏感性蚕品种蛋白氨基酸的突变对三级结构的影响。结果显示,抗性与敏感性蚕品种的AChE共有4个氨基酸差异,分别是抗性18位的异亮氨酸、486的天冬氨酸、553的赖氨酸、606的缬氨酸突变为敏感的蛋氨酸、甘氨酸、谷氨酸和丙氨酸。抗性与敏感性蚕品种GSTs只有1个氨基酸差异,即抗性93位的缬氨酸突变为敏感的丙氨酸。氨基酸的差异对其三级结构产生一定影响,从而影响酶活性,使家蚕的抗性发生改变。 (2)家蚕乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶基因的的转录表达分析。本文研究了对农药具有抗性及敏感性家蚕体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)基因的相对表达量。结果显示,农药抗性与敏感性家蚕脂肪体中AChE与GSTs基因的相对表达量具有明显差异。在脂肪组织中,农药抗性家蚕品种脂肪体AChE的相对表达量明显高于敏感性蚕品种,尤其是在5龄中期(5龄第4天)以前。抗性家蚕品种脂肪体中GSTs相对表达量随着龄期的增加而显著升高,而敏感性蚕品种则维持较低的相对表达量水平,到了5龄中期以后,两者间的相对表达量差异更大。以上研究表明有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂农药进入蚕体后,脂肪体中的AChE和GSTs都参与重要的解毒作用,脂肪体是家蚕重要的解毒器官。 (3)乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性与家蚕对农药的抗性密切相关。本文测定了对农药具有抗性及敏感性家蚕体内的乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性。结果显示,农药抗性与敏感性家蚕中肠AChE活性具有明显差异,同一时期比较,农药抗性家蚕中肠的AChE显著高于敏感性家蚕;抗性家蚕品种血液中谷胱甘肽-S-转移酶活性随着龄期的增加而显著升高,而敏感性蚕品种则维持较低的活性水平,到了5龄第6天,两者活性相差近5倍;抗性家蚕品种脂肪体谷胱甘肽-S-转移酶活性也明显高于敏感性蚕品种。以上研究表明有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂农药进入蚕体后,中肠组织中的AChE首先参与其解毒作用;当农药进入血液和脂肪体组织后GSTs作为重要的解毒酶参与作用。 (4)我们分别从杭州市河道污染较严重的钱塘河及备塘河取污水,浸渍桑叶后喂蚕,调查家蚕的慢性中毒症状、死亡率,眠蚕体重等,并测定了家蚕体内乙酰胆碱酯酶及谷胱甘肽-S-转移酶活性,评估家蚕作为农业生境污染物残留检测的技术可行性。实验结果表明,所取的不同来源污水对家蚕的影响表现为(荫)性中毒,从2龄起蚕始添食污水浸渍桑叶,直到4眠蚕体重才明显低于对照蚕;但作为抗性指标的家蚕体内乙酰胆碱酯酶及谷胱甘肽-S-转移酶活性,却在3眠时期就已经显著降低,因此相对于表型,家蚕体内乙酰胆碱酯酶及谷胱甘肽-S-转移酶活性可作为农业生境污染物的前置检测指标。 本研究结果表明:乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶基因结构、转录表达量及其酶活性与家蚕对农药的抗性密切相关。