拮抗细菌菌株Bacillus subtilis A30分离自水稻叶围。平皿测试表明Bacillus subtilis A30对多种植物病原菌，如病原真菌水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)等，病原细菌稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)等有强烈抑制作用。 对该菌株的生长曲线及活性曲线进行分析，可知当细菌生长到对数生长中期时(OD600约为3.5)，拮抗活性开始被检测出；在细菌生长进入稳定生长期后，拮抗活性达到最大，随后趋于稳定。 将拮抗菌A30菌株接种于LB液体培养基中，37℃下培养26小时，然后8000rpm离心20min去菌体，所得的去菌培养液用40％的硫酸铵沉淀过夜后12000rpm离心20min。将得到的沉淀用磷酸缓冲液悬浮，悬浮液离心去杂后通过FPLC疏水色谱和HPLC反相色谱进行分离纯化，最后纯化得到一种拮抗物质P1。经LC-ESI-MS质谱初步判断其分子量为1476.7Da。P1物质经酸处理后活性有部分降低，对碱稳定；经120℃高温处理30min仍保持活性；同时该物质对蛋白酶K和胰蛋白酶以及乙醇、异丙醇，乙腈等有机溶剂具有稳定性。另外，P1的茚三酮反应为阴性，但经酸水解后，茚三酮反应和双缩脲反应呈阳性。根据以上结果推测它可能为一种环肽，或者为含有非氨基酸组分的肽类化合物。但拮抗菌A30菌株去菌培养液经40％的硫酸铵沉淀后所得的悬浮液通过30KDa分子量截流管截流试验发现，拮抗物质可被截流管截流，由此分析其分子量应大于30KDa，这可能是因为拮抗物质与某种大分子结合造成的。 用含Tn917转座子的pTV1-OK质粒转化A30菌株感受态细胞，在红霉素和卡那霉素双抗培养基上筛选获得6个转化子，经质粒检测发现这六株转化子均含有质粒。利用pTVl-OK质粒含有温度敏感基因的特点，通过43℃高 浙 o 大 攀 习 士 学 位 论 文 纫 婴 温处理和红霉素／卡那霉素培养基筛选，获得一批对卡那霉素敏感（丧失质粒） 但对红霉素有抗性（转座子 Tugl7插入染色体 DNA）的突变株。经抽样活性 检测发现这些突变株丧失了拈抗活性。另外，用一系列浓度梯度递增的利福 平诱导得到的A30抗利福平突变株，其不仅具有与野生株相似的形态，还表 现出与野生株相近的桔抗活性。 水稻纹枯病菌菌丝块经桔抗细菌A30菌株的去菌培养液处理后，在滤纸 上生长很缓慢，且有纠集状白色颗粒（菌丝纠集体）出现；而对照菌丝块在 滤纸上生长较快，菌丝舒展，无纠集现象。通过光镜观察，前者的菌丝有生 长扭曲，分枝增多、缩短，菌丝明显变细等异常形态学变化；而对照则生长 正常，菌丝粗壮。同时，研究发现浸过桔抗细菌A30菌株去菌培养液的菌核 萌发率只有24％，菌丝稀疏、细弱；对照菌核萌发率高达86％，菌丝浓密、 粗壮。经水稻叶片离体试验，用A30去菌发酵液浸过的水稻纹枯病菌菌丝块 比正常生长的水稻纹枯病菌菌丝块侵染水稻叶片的能力低：形成的病斑数量、 大小也要少。在田间试验中A30菌株发酵液对水稻纹枯病表现出了较好的防 治效果，防效与井岗霉素相当。