高选择性肿瘤化疗是目前研究的重要课题之一，大多化疗药物缺乏对肿瘤组织的高选择性，往往在对肿瘤组织发挥作用的同时也对身体正常组织产生毒副作用。为了解决这些问题，人们希望通过单克隆抗体直接将毒性药物特异地带到肿瘤组织部位，单克隆抗体与毒性药物连接成“抗体-药物”偶联物，单克隆抗体特异地与肿瘤组织内的抗原结合，从而将药物带到肿瘤组织部位，发挥杀死肿瘤细胞的作用。但经过实践发现，“抗体-毒性药物”偶联物并不能 第③零医夭管砸士管硅伦支非常有效地到达肿瘤部位发挥作用，这是因为：门）一定量的抗体所携带的药物数量毕竟有限，（2）每一种肿瘤组织中含有的抗原数量多少不一，有些肿瘤组织中所含有的能与抗体有效结合的抗原数量非常有限，（3）抗体与毒性药物形成大的“抗体－药物”交联物，难以有效地达到实质性肿瘤部位，（4）“抗体－药物”交联物分于较大，易引起免疫反应，影响其在病人中的应用。 1987年，Bngshawenl提出“抗体导向酶哺药疗法＼AD EPT）引起了人们的广泛关注，其设想利用抗体作为载体来携带前体药物的专一性活化酶，可以选择性地结合于肿瘤部位。此前体药物能在人体内稳定存在，并且对身体正常组织没有或仅仅有非常低的毒性作用，但可以区域特异性地在肿瘤组织内被抗体所携带的酶转化为活性细胞毒分于，发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。这种设想利用少量的酶即可催化前药生成大量有肿瘤细胞毒性的药物，而且前药的分于量较小，比较容易达到实质性肿瘤部位，克服T“抗体。药物”大分于难以达到肿瘤组织的问题，只需要少量的抗体－酶交联物就可以在肿瘤部位催化大量的前药变为有毒性作用的活性药物。 Huennekens等＊l将抗人肺癌单克隆抗体 McAb KSI／4与竣肽 4 第＠军医丈学碾士管硅萌支酶A（CPA）交联，制备成KS l／4（PA交联物，并且将甲氨酸吟的a氨基酸进行修饰以获得ADEPT前药，其中前药甲氨碟吟A－丙氨酸（MTX＊《lan劝e）可以被CPA酶解成为有细胞毒活性的药物甲氨骤吟（MTX）。体外肺癌细胞毒性试验发现，前药IC50为二．2X 10‘moVL，力入交联物 48h后，IC扣为 6．3 X 10‘moUL，降低 了约 35倍。本实验室郝晓柯等f3I合成了两种前药甲氨瞟吟川－肽衍生物：甲氨碟吟J－苯丙氨酸和甲氨碟吟川。精氨酸（MTX＊ he，MTX a－吨），并进行了体外细胞毒试验。结果发现，前药对任何细胞均无毒性，但经梭肽酶A水解后，MTX－aPhe转化为活性的MTX，其细胞毒活性大于iJ药约 1000 ｛f。用抗人精浆蛋白单克隆抗体／骏肽酶A交联物（E4B7．ra－－Ab。CPA）进行前列腺癌动物模型的体内试验，抑癌率也在85％以上。 酶是ADEPT治疗方案中的一个重要组成部分，其可以分为两大类：l）非人源化酶，这是目前ADEPT研究中大多应用的酶。特异性虽好，但兔疫原性相对较强，易引起免疫反应，免疫抑制剂的应用在一定程度上可以延缓患者免疫反应的发生，但兔疫抑制剂只是在动物模型中获得了较理想的实验结果，也仅仅在ADEPT方 5 第＠零医大管涤士学伯论支 案中能应用两到三个循环；2）人源性酶（内源性酶），虽免疫原性 较低，不易引起兔疫反应，但特异性较差。因在身体的正常组织中 也存在相同的酶，可以在非肿瘤组织催化前药转变为有毒性的药 物，引起全身毒副反应，因而也迟迟不能应用于临床l‘－八 本实验通过计算机模拟人梭肽酶 AhCPA）的结构，设计突 变位点，并应用PCR重叠延伸法对其进行定点突变。引物A、B为 竣肽酶A基因两端引物，完全与竣肽酶A基因两端互补，在两边分 别设计了不同的酶切位点，5’端为限制性内切酶EcoR J，3’端为 Saflo 引物C、D为突变引物，其包含了突变位点，将11 26位的核 昔酸G突变为A，GCC为hCPA376位氨基酸密码子，编码丙氨酸， ACC为突变后的376位的密码子，编码苏氨酸。 我们首先以A，D引物PCR出大约 1126hP的产物，应用琼脂 糖凝胶电泳鉴定，纯化，回收；以B，C引物PCR出大约125hp的 产物，鉴定，纯化，回收，再应用这两个产物做重叠延伸，得到了 大约1250hP的产物，符合我们的要求，应用DNA测序仪进行测序， 结果在1126位的核昔酸由G变为A，其余序列未变。 此酶突变体可以将MTX－a－环丁基苯丙氨酸水解为有毒性的 6 第一零医丈营＠寸营懂范支甲氨碟吟，而内源性的浚肽酶不能将此底物催化，这样就可能避兔了应用内源性酶特异性差，可能在肿瘤组织以外的正常组织中活化前药分于，产生毒副作用的缺点，另一方面因为此突变酶和内源性酶有较大的同源性，故免疫原性较低，不会引起全身的免疫反应，或仅仅引起较低的免疫反应，使ADEPT方案可以