论文部分内容阅读
本实验室已经证明半胱氨酰白三烯受体1(cysteinyl leukotriene receptor 1, CysLT1受体)拮抗剂的抗脑缺血损伤作用。选择性CysLT1受体拮抗剂普鲁司特(pranlukast, ONO-1078)可抑制大鼠和小鼠的急性、亚急性及慢性局灶性脑缺血损伤。在小鼠局灶性脑缺血慢性期,普鲁司特不仅可降低死亡率,促进神经功能恢复,还可抑制胶质疤痕形成。但是,有待进一步的阐明其他CysLT1受体拮抗剂抗脑缺血损伤的作用。在细胞水平上,已经报道CysLT1和CysLT2受体转染对PC12细胞缺血性损伤的调节作用,CysLT1受体介导轻度缺血损伤后星形胶质细胞增殖,但其在神经元缺血损伤中的作用,还需要继续深入探讨。多数动物实验采用的CysLT1受体拮抗剂是普鲁司特,其作用是CysLT1受体拮抗剂共同的作用,还是该药特有的作用?为此,研究了另一个CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特。孟鲁司特[1-{[(1(R)-(3-(2-(7-氯-2-喹啉)-(E)-乙烯基)苯基)-3-(2-(1-羟基-1-甲基乙基)苯基)丙基)硫醇]-甲基}环丙乙酸]是分子结构不同于普鲁司特的选择性CysLT1受体拮抗剂。本实验室发现,腹腔注射孟鲁司特对小鼠急性局灶性脑缺血损伤有剂量依赖性保护作用,可减轻神经症状、减小梗死体积、减轻神经元缺失、减少血脑屏障通透性增高,治疗时间窗在缺血后0.5 h,其作用强度和特点与普鲁司特相似。但是,孟鲁司特对局灶性脑缺血后慢性损伤的作用还未得到研究,因此,本研究第一部分在大鼠和小鼠局灶性脑缺血模型中,观察CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特对脑缺血慢性损伤是否有保护作用,口服是否有效。CysLT1受体拮抗剂除了选择性阻断CysLT1受体而发挥效应外,还有不依赖于CysLT1受体的作用,孟鲁司特是否也具有这种作用?另一方面,神经元损伤受胶质细胞等其他细胞的相互调节,孟鲁司特是否影响胶质细胞而调节神经元缺血性损伤?针对这些问题,本研究第二部分在大鼠原代神经元培养和皮质细胞混合培养中,验证孟鲁司特在整体试验中的神经保护作用；同时,探讨其神经元保护作用环节、是否依赖CysLT1受体以及与胶质细胞作用的关系。第一部分孟鲁司特对小鼠和大鼠局灶性脑缺血慢性损伤的作用目的：(1)在小鼠模型阐明孟鲁司特对局灶性脑缺血慢性损伤的治疗作用,并与普鲁司特进行比较。(2)在大鼠模型确定孟鲁司特口服给药,是否对慢性局灶性脑缺血损伤有保护作用,并与临床有效的抗氧化药依达拉奉(edaravone)进行比较。方法：以大脑中动脉阻塞方法诱导局灶性脑缺血后,小鼠腹腔注射孟鲁司特(0.01和0.1 mg/kg),共5天；大鼠灌胃给予孟鲁司特(0.1和0.5 mg/kg),共5天。缺血后28天内,观察行为学异常以评价神经功能损害,包括神经症状评分、转角试验(小鼠)和伸爪试验(大鼠)。28天后,观察脑损伤体积、脑萎缩和神经元缺失变化,以评估脑损伤改变。结果：孟鲁司特(0.1 mg/kg)减轻小鼠局灶性脑缺血后的行为学异常、脑损伤体积、脑萎缩和神经元缺失,其作用与普鲁司特(0.1 mg/kg)相似。大鼠经口给予孟鲁司特(0.5 mg/kg)也显著减轻慢性损伤,其作用强于依达拉奉(10 mg/kg);尤其对于提高伸爪试验成功率的作用较为明显。但是,孟鲁司特对于大鼠和小鼠脑缺血后的死亡率没有作用,表明其不能对抗非常严重的脑缺血损害。结论：(1)CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特对小鼠局灶性脑缺血慢性损伤有保护作用,其有效剂量为0.1 mg/kg,与普鲁司特作用基本相仿。(2)首次表明,口服孟鲁司特对大鼠局灶性脑缺血慢性损伤也具有显著的保护作用,对改善大鼠术后精细行为改变有较显著的作用,其有效剂量为0.5 mg/kg。这些发现支持CysLT1受体拮抗剂治疗缺血性脑卒中的潜在价值。第二部分孟鲁司特对神经元缺血性损伤的作用目的：(1)确认孟鲁司特对神经元体外缺血性损伤有无保护作用；对凝血酶诱导的损伤(脑缺血后继发性出血损伤)是否有保护作用。(2)确认孟鲁司特对神经元缺血性损伤的保护作用是否通过拮抗CysLT1受体；与混合培养的胶质细胞有无作用。方法：在大鼠皮层神经元及混合培养细胞,选择OGD及恢复的最佳损伤条件(OGD 2 h/R 24 h,OGD/R);以凝血酶(0.1～100 U/ml)诱导神经元损伤。损伤前以不同浓度孟鲁司特及LTD4预处理。神经元损伤以细胞存活率(MTT还原试验)、LDH漏出率、凋亡率(Hoechst 33258染色)、神经元数量及形态加以评价；并观察神经元CysLT1受体表达(免疫染色)、活性氧(ROS)产生、小胶质细胞形态变化。结果：在神经元,孟鲁司特在0.01～10μM浓度范围内显著保护OGD/R诱导的缺血性损伤,减轻存活率降低、LDH漏出、凋亡率、神经元数量减少及形态改变；孟鲁司特对凝血酶诱导的神经元损伤无保护作用。CysLT1受体激动剂LTD4(1-100 nM)对神经元OGD/R损伤的有一定的保护作用,但两药(孟鲁司特0.01μM+LTD4 1-100 nM)无协同作用。孟鲁司特(0.01～10μM)能显著抑制OGD/R诱导神经元ROS的产生,但LTD4(10-1000 nM)无显著作用。在混合培养细胞,孟鲁司特(0.0001～1μM)显著改变OGD/R后神经元形态,但LTD4(0.1-1000 nM)基本无作用。孟鲁司特(0.0001～0.01μM)和LTD4(1-1000 nM)显著减少OGD/R诱导的小胶质细胞激活,但两药(孟鲁司特0.01μM 1+LTD4 100 nM)无协同或拮抗作用。结论：(1)孟鲁司特对OGD/R诱导的神经元缺血性损伤有保护作用,而对凝血酶诱导的损伤无效,证明其抗脑缺血作用至少部分由于其抗神经元缺血性损伤的作用。(2)孟鲁司特对神经元缺血性损伤的保护作用与其抗氧化作用以及抑制小胶质细胞激活相关,而不依赖CysLT1受体。