论文部分内容阅读
肝素是一类高度硫酸化的线性糖胺聚糖,具有抗凝血、抗血栓、抗病毒、抗炎症及抗肿瘤等作用,但研究表明,在肝素应用的过程中常伴随着很多不同的副作用,例如肝素诱导性血小板减少、过敏反应等。相对来说,由普通肝素通过裂解得到的相对分子量较低的低分子量肝素和超低分子量肝素不仅具有更高的抗凝血活性,并且副作用更小,因此其研究与制备受到越来越多的关注。目前来说,低分子量肝素类产品主要是通过化学方法制备,该法处理效果过于激烈容易导致肝素结构发生改变,失去生物活性。相比之下,肝素酶裂解法反应条件温和,不影响肝素本身的结构特征,产物得率较高;反应一步完成,且几乎不产生杂质,比较利于下游的分离纯化。因此,肝素类药物的酶法生产研究具有重要的工业化应用前景。肝素酶是一类能够专一性地裂解肝素和硫酸类肝素糖苷键的蛋白质。肝素酶裂解法生产肝素类药物需要解决的关键问题是肝素酶来源狭隘以及酶制备成本高。因此,筛选高产肝素酶的新型微生物以及构建高效表达可溶性肝素酶体系就显得尤为重要。本课题正是基于以上问题,从自然界土壤中分离出产肝素酶的新型微生物——拉乌尔菌Raoultella sp.NX-TZ-3-15并对其发酵条件进行优化研究,对该菌的全基因组测序结果进行分析,得到新型肝素酶的基因序列H1（684 bp）和H2（699 bp）,利用无缝克隆和组装技术直接克隆该新型肝素酶,构建重组质粒导入大肠杆菌,高效表达可溶性肝素酶。本论文主要结果如下:（1）本课题通过对屠宰场附件的土壤进行筛选,得到了一株肝素酶高产菌,并且通过形态观察、对菌株的16S rDNA扩增产物进行测序和BLAST同源性比较,确定该菌株属于拉乌尔菌属（Raoultella sp.）,并将该菌命名为Raoultella sp.NX-TZ-3-15。（2）以Raoultella sp.NX-TZ-3-15为出发菌株,对影响该菌株生长和代谢的发酵培养基成分和培养条件进行了研究,得到了最优的发酵培养基——1%麦芽糖,1%大豆蛋白胨,0.25%KH2PO4,0.025%MgSO4·7H2O,0.2%肝素钠;以及最优培养条件——初始pH 9.5,10%接种量,37℃,200 rpm,24 h。（3）将Raoultella sp.NX-TZ-3-15进行全基因组测序,利用生物信息学技术对测序结果进行分析,得到新型肝素酶的基因序列H1和H2。以Raoultella sp.NX-TZ-3-15 DNA为PCR模板获得目的基因H1和H2,再通过无缝克隆与组装技术成功与质粒pBENT构建出重组质粒pBENT-H1和pBENT-H2,并转入大肠杆菌感受态细胞E.coli BLR（DE3）。通过菌落PCR,重组质粒单酶切以及测序等方法对重组工程菌进行验证,结果表明克隆成功。（4）重组工程菌诱导表达结果表明:E.coli BLR（DE3）pBENT-H1和E.coli BLR（DE3）pBENT-H2两株重组工程菌表达的目的蛋白主要在上清液中,均可溶,蛋白分子量大小为25 kDa。E.coli BLR（DE3）pBENT-H1的酶活为1650 U/L,是原菌酶活的4.34倍,但E.coli BLR（DE3）pBENT-H2几乎没有肝素酶活性,在后续研究中,选择E.coli BLR（DE3）pBENT-H1作为进一步的研究对象。（5）E.coli BLR（DE3）pBENT-H1的诱导条件优化研究结果表明,其诱导和表达肝素酶的最优条件为:在37℃,200 rpm条件下培养3.5 h至菌液OD600为0.7左右时,加入IPTG（100 mM）至终浓度为0.25 mM,30℃,200 rpm诱导8 h,肝素酶酶活最高可达2140 U/L。