磷脂酰肌醇—3—激酶(PI3Ks)是参与酪氨酸激酶受体介导的信号传导酯激酶，由三类复杂的家族成员组成，每一类有多个亚单位和亚型。PI3Kα是这个家族中研究最多的一种酶，它是具有接头功能的异源二聚体蛋白，由一个催化亚基(p110α)和一个85kDa的调节亚基(p85α)组成。PI3K信号传导通路是细胞生长、增殖、存活、肿瘤发生的调节因子。许多文献已提示PI3K在许多类型细胞周期进程中起中枢调控作用，PI3K不仅在G1/S期转换时起作用，还可能调节G2/M期转换效率，但是在此进程中PI3K亚型的特异作用尚未详尽阐释。目前有关PI3K在哺乳动物受精卵早期发育过程中作用报道仍然很少。尽管已有文献报道PI3K可能在前植入胚泡中调控细胞的葡萄糖代谢，但是P13K各亚型在胚胎发育中的生理作用尚未进行深入探讨。ⅠA型PI3K的催化亚基p110α不仅在果蝇的细胞生长中起作用，而且在小鼠的早期胚胎发育中也起重要作用。但该作用的机制是什么，从何时开始发挥尚不清楚。在过去的十几年中，很多学者进行了PI3K/ Akt(蛋白激酶B/PKB)通路广泛的研究，研究提示该通路在细胞的迁移、有丝分裂发生、分化、细胞存活中起到关键调节子的作用。一些结果显示Akt在哺乳动物细胞的周期进展中促进G2/M期转换，然而尚未完全了解P13K/Akt信号通路的直接联系以及它们在G2/M转换中的调控作用。在分裂的真核细胞中，M期促进因子(MPF)掌控有丝分裂的入口。MPF可能通过磷酸化与去磷酸化cdc2对G2/M转换进行紧密调节。 材料与方法： 一、材料与试剂 中国医科大学实验动物部提供昆明系雌性小白鼠；一抗(Santa Cruz)，碱性磷酸酶连接的二抗(Sigma)，ECL发光试剂盒(Pierce公司)，快速微量mRNA提取纯化试剂盒(GE Healthcare UK公司)，RNA PCR Kit(AMV) Ver2.1(Takara公司)。pBJ-P110α—WT，pBJ-P110α—AC，pBJ-P110α—KD由Anke Klippel教授惠赠。PHl-P110α shRNA/control shRNA由Osamu Hazeki教授(Hiroshima University)惠赠。pSUPER—mTOR shRNA，pSUPER—raptor shRNA和pSUPER—rictor shRNA由Estella Jacinto教授惠赠。E.coli DH5α感受态细菌、氨卞青霉素(Takara公司)，LB培养基(Invitrogen)，UNIQ—10柱式DNA胶回收试剂盒以及质粒小量提取试剂盒(上海生工)，去内毒素质粒中量提取试剂盒(OMEGA公司)，O—dianidine、β—naphthyl acid phosphate、PKB及MPF活性测定试剂均为Sigrna公司产品。 二、小鼠超排卵及受精卵的采集和培养 三、重组载体的构建 四、体外转录 五、mRNA显微注射 六、shRNA胞核显微注射 七、RT-PCR检测1—细胞期受精卵中p110α、mTOR、 raptor、rictor和S6K1的mRNA水平 八、Western印迹 九、细胞免疫荧光定位 十、放射自显影检测Akt活性和MPF活性 结果： 一、小鼠受精卵中p110α的表达水平 结果显示，与蛋白表达水平一致，p110α在受精后四个期的mRNA水平无明显差异。 二、p110α在1—细胞期或2—细胞期胚胎中的定位 结果显示，p110α定位在卵细胞的细胞膜上。这个结果说明了在小鼠受精卵的发育过程中p110α，发挥作用可能与细胞膜上的蛋白密切相关。 三、 p110α shRNA抑制p110α的表达 为了检测p110α shRNA是否可以削减内源性的p110α蛋白水平，在G1期显微注射TE、control shRNA或者p110α shRNA的受精卵于M16培养液中进行培养。在20小时的培养后，收集卵细胞进行RT-PCR和Western Blot实验。结果显示1mg/ml的p110αshRNA可以较彻底的抑制内源性p110α的表达，而对照组TE与control shRNA注射组则相反。 四、 p110α shRNA和p110α mRNA调控1—细胞期受精卵的分裂 分别在hCG注射27h和32h后计算每组细胞的分裂率。在对照组，hCG注射后27小时，胚胎未分裂，在hCG后32h，68％的1—细胞胚胎分裂成2—细胞胚胎。三个对照组组间没有明显的区别。与control shRNA处理组的胚胎相比，p110α的沉默明显抑制1—细胞胚胎的分裂，说明p110α shRNA干扰小鼠1—细胞胚胎的G2/M期转换。显微注射p110α—WT mRNA的1—细胞期胚胎在hCG注射27h后处于1—细胞阶段，在32h后79％的胚胎达到2—细胞阶段。显微注射p110α—AC mRNA的1—细胞期胚胎在32h的分裂率达到90％，并且分裂加速，在27h已有24％的胚胎分裂。在32h可见不规则分裂。相比，注射hCG32h后，约38％显微注射p110α—KD mRNA的胚胎进行分裂。显微注射不同的p110αmRNA，不仅可以调节1—细胞胚胎的分裂时程，而且可以调节胚胎的分裂率。 五、p110α shRNA和p110α mRNA的显微注射调节Akt和MPF的活性 通过p110α shRNA和各组p110α mRNA显微注射到胚胎，调控1—细胞阶段的胚胎发育，提示p110α在调控小鼠胚胎分裂方面的作用。为进一步研究p110α调控1—细胞胚胎发育潜在机制，通过内源性p110α的缺失以及p110α三种mRNA的过表达，检测p110α在Akt和MPF信号通路上的效应。首先，确定1—细胞期胚胎中的内源性Akt的激活时程。Akt的活性在hCG注射后27h达到峰值，在28—30hAkt的活性明显降低。因此我们选择在hCG注射后26—27h检测Akt的活性变化。在p110α shRNA显微注射组与control shRNA对照组相比，Akt的活性明显降低。在p110α—WT mRNA mRNA显微注射组，Akt的活性几乎是对照组活性的2倍；在p110α—AC mRNA显微注射组，Akt的活性几乎是对照组活性的3倍。然而，在p110α—KD mRNA显微注射组，Akt的活性却低于对照组的活性。 六、小鼠受精卵各期中S6K1的表达和定位 S6K1的mRNA水平在G1、S、G2、M期似乎没有什么变化。通过蛋白免疫印迹分析显示S6K1在小鼠受精卵的各期中70KD的条带在强度或者移动率方面也没有什么变化。通过免疫荧光染色分析S6K1的亚细胞定位，显示代表S6K1的绿色荧光信号主要分布在1—细胞的胞浆中。 七、小鼠受精卵中Thr389位磷酸化的S6K1的表达和定位 Thr389位磷酸化的S6k1可以反映S6K1的活性，通过蛋白印迹实验检测Thr389位磷酸化的S6k1表达情况。Thr389磷酸化的S6k1在小鼠受精卵中从G1期到M期一直出现，在G2期和M期的表达明显增高，灰度值统计分析表明，差异具有显著性，说明S6K1在整个1—细胞期中是有活性的。既然蛋白的细胞定位在某种程度上反映蛋白的功能，通过免疫荧光染色的方法检测Thr389磷酸化的S6k1的定位，实验结果显示Thr389位磷酸化的S6k1主要定位在1—细胞胚胎的细胞膜，但是在胞浆仍旧有微弱的染色。 八、raptor和S6K1的共定位 通过用S6K1与raptor抗体的双染检测S6K1与raptor的定位是否相关。S6K1的分布与raptor的分布是一致的，二者同时定位在胚胎的胞浆中。 九、 mTORC1对S6K1的Thr389磷酸化起作用 为了检测哪一型mTOR的复合物对于S6K1的磷酸化是主要的，使用小发夹RNA干扰的方法抑制mTOR以及它的相关蛋白的表达。结果显示mTOR shRNA的显微注射可以抑制mTOR的转录，raptor shRNA可以降低raptor的mRNA水平，同理rictor shRNA。在注射pSUPER—mTOR shRNA/raptor shRNA/rictor shRNA的受精卵中β—actin的mRNA水平一致。削减的mTOR或者raptor的表达，可以强烈的抑制S6K1Thr389的磷酸化，而rictor不能。 结论： 1、小鼠受精卵第一次有丝分裂过程中p110α分布在1—细胞期和2—细胞期胚胎的细胞膜上，含量却不变。 2、p110α表达沉默可降低Akt和MPF活性，进而干扰受精卵G2/M期转换，使卵裂率明显降低。编码结构活性p110α mRNA比野生型p110α mRNA更有效的促进受精卵的分裂率；激酶失活型p110α mRNA延迟首次有丝分裂。进一步研究显示p110α可能通过PI3K/Akt的信号传导通路影响MPF的活性，进而促进小鼠胚胎的早期发育。 3、小鼠1—细胞期受精卵的四个期(G1/S/G2/M)中S6K1表达水平一致，T389位磷酸化的S6K1在G2期和M期高表达。Raptor亚基与mTOR结合可诱导S6K1的T389位磷酸化，并向细胞膜移动。