背景及目的随着现代社会的发展,交通事故、地震、肿瘤手术等导致神经缺损的人数在逐年增加。周围神经损伤在所有创伤患者中的发病率约2.8%。我国周围神经缺损病例每年新增60~90万例,若治疗不当可造成终生残疾,带来严重经济负担和社会负担。自体神经移植是修复周围神经缺损较为理想的方法,在临床上已广泛应用,也是判定各种神经桥接材料的“金标准”。但自体神经移植造成供体神经支配区感觉、运动障碍,且自体神经来源有限,因此临床上迫切需要更安全有效且来源广泛的神经移植材料。近年来组织工程技术得到了飞速发展,将组织工程技术运用于周围神经再生和修复,是近年来神经损伤修复的一个研究热点。组织工程化神经为改善周围神经缺损的修复带来了新希望。组织工程神经与自体神经移植最大的区别在于他们所营造的不同再生微环境。为了克服组织工程神经天生的不足,创造一个有利于周围神经再生的微环境,我们一直在努力的寻找一种好的解决方法。体内细胞所处的局部微环境是三维立体的,它们的运动经常受到局部化学信号或分子的影响。传统的细胞体外培养多采用单层贴壁培养法,研究发现这种培养方法使细胞处于二维平面上,无法模拟具有空间结构的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和细胞之间的相互作用,更无法实现三维微环境中多种信号对细胞的调节作用。因此,传统的培养方式常导致细胞部分生物学特性的改变,甚至导致一些关键的细胞表型及功能的缺失。在人工神经移植物发展上,天然生物材料被设计为三维(3D)支架或水凝胶并进一步被设计以支持神经元生存、粘附、增殖和引导。本课题从天然材料蚕丝中获取灵感,即仿生学思路,设计合成丝素蛋白多肽,水凝胶化制成三维支架。研究其对神经细胞生长和发育的影响及机制。本课题的目的在于:1、通过生物信息分析丝素蛋白氨基酸序列确定一段由16个氨基酸组成的高度保守序列(SGGAGGAGGAGGAGGS,SF16),通过人工合成和纯化,并检测其一般特性。研究SF16多肽分子自组装条件及自组装后多肽水凝胶的理化性质检测。2、自组装丝素蛋白多肽生物支架材料(SF16)与PC12细胞共培养,研究其对神经细胞形态、生存、增殖、粘附的影响。3、建立大鼠坐骨神经缺损模型,将SF16水凝胶支架材料植入到坐骨神经损伤部位,探讨SF16水凝胶支架材料修复坐骨神经缺损的效果。方法1、采用自动多肽合成仪合成多肽分子SF16,通过高效液相色谱仪及质谱仪分析纯化,应用400型分光光度计及原子力显微镜观察多肽分子圆二色性及空间结构。凝胶化制得SF16支架材料,通过扫描式电子显微镜和原子力显微镜检测自组装多肽凝胶材料的超微结构。2、SF16支架材料与PC12细胞培养,用倒置相差显微镜观察细胞的形态和增殖情况,并通过用荧光分光光度计测量每个样本中DNA含量并记录。提取总RNA进行荧光实时定量PCR检测,提取总蛋白进行蛋白水平检测。3、SF16支架材料用于修复10mm坐骨神经缺损动物模型,胶原蛋白凝胶为阳性对照组,生理盐水为阴性对照组,通过神经电生理研究、神经再生的组织学分析、有髓轴突再生的评价等方法评价神经修复效果。结果1、SF16多肽分子的圆二色性(CD)测定表明在194nm处有较强的负峰,在223nm处有较弱的负峰。SF16多肽的化学结构和空间结构在溶入去离子水后形成,p H值3.4左右产生乳白色半透明外观,通过原子力显微镜可以观察到纳米棒的刚性结构。我们的结果显示这些纳米棒的直径可达80nm,长度达5μm。SF16多肽水凝胶原子力显微镜显示SF16多肽已经被成功地整合到支架上,展现出海绵状结构和相互交错的网状结构。2、细胞共培养显示:细胞在水凝胶中分布地相当均匀,细胞的数量随着培养时间的增加逐渐增加。在第7天,可以在胶原蛋白和多肽水凝胶中观察到圆形的、群集的活细胞,表现出了超强粘附的形态。在SF16多肽和胶原蛋白水凝胶中培养的PC12细胞的DNA含量随着培养时间增加而逐渐增加,DNA含量的最高值分别是生理盐水组的约3.68倍和5.19倍。通过实时定量PCR和免疫印迹分析我们发现,由PI3K/AKT/m TOR信号控制的细胞生长信号和粘附分子在SF16多肽水凝胶中培养的PC12细胞中特异性高表达,如p70S6K1、4EBP1和钙粘蛋白家族(E-和N-钙粘蛋白)。3、动物实验显示,SF16组神经传导恢复的幅度明显高于生理盐水组。SF16组的施万细胞数量和密度明显地高于生理盐水组,而且延伸规整。SF16组的神经缺损部位的神经纤维与生理盐水组的相比,排列地更规则,密度更高。结论1、SF16多肽成功合成,可自组装成具有海绵状结构,相互交错网状结构的凝胶材料。2、SF16水凝胶材料可以促进PC12细胞增殖、粘附及调控细胞信号通路传导。3、SF16水凝胶支架作为单纯的基质可以更好地促进轴突再生和神经功能恢复,其可能的机制是SF16多肽可能诱发PI3K/AKT/m TOR信号通路并进一步促进细胞生长和增殖。SF16多肽可能是一种新的有效的神经组织工程支架材料。