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本文以新鲜赤子爱胜蚓为原料,经磷酸盐缓冲液抽提得到蚯蚓组织粗提物,经硫酸铵沉淀得到蚯蚓粗蛋白。采用经典的整体动物模型-致敏豚鼠抗原攻击引起的哮喘模型对蚯蚓平喘有效部位进行了筛选,并通过离体豚鼠气管平滑肌初步分析了有效成分的作用机制。结果表明:在整体试验中,蚯蚓粗蛋白口含吞服或肌肉注射均可明显抑制致敏豚鼠抗原攻击引起的哮喘反应,通过离体气管平滑肌初步分析其作用机制表明可能与抗白三烯作用有关。
在此基础上,利用DEAESepharoseTMFF阴离子交换树脂对蚯蚓粗蛋白按离子强度进行分级,得到四个蛋白组分:蛋白EP1、蛋白EP2、蛋白EP3和蛋白EP4。对这四个蛋白组分进行了平喘作用的研究。采用卵白蛋白致敏形成豚鼠哮喘模型,通过测定肺阻力(RL)和动态肺顺应性(Cdyn)的变化来评价受试样品是否有平喘作用(抑制支气管收缩和抗过敏作用)。结果显示这4个样品都有一定的平喘作用,但蛋白EP2作用最强,稍弱于阳性对照药孟鲁司特,其强度顺序为蛋白EP2>蛋白EP4>蛋白EP3>蛋白EP1。离体实验采用豚鼠离体气管平滑肌,以LTD4收缩平滑肌,观察各样品拮抗LTD4的作用。结果显示蛋白EP2和蛋白EP4能明显拮抗LTD4收缩气管平滑肌的作用,作用强度与孟鲁司特接近,而蛋白EP1和蛋白EP3无明显影响。
利用蛋白质组学的核心技术双向凝胶电泳-质谱技术,对平喘活性蛋白组分EP2进行分离、分析和鉴别。成功构建出活性蛋白组分EP2的双向电泳图谱,对凝胶电泳中丰度较高的蛋白质,经胶内酶切后,用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行肽质量指纹谱分析(PMF)或串级质谱分析,共鉴定出19个蛋白,为蚯蚓平喘蛋白成分的进一步纯化和作用机制的研究提供了线索。
本实验结论:赤子爱胜蚓中蛋白成分有平喘的作用,作用靶点可能通过拮抗白三烯受体。以上研究结果为蚯蚓抗哮喘研究开创了新途径和新方法。