黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)为唇形科(Labiatae)、黄芩属(Scutellaria)、一年或多年生药用植物,具有调节免疫和抗肿瘤等多种药理活性。近年来,黄芩在调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等方面得到广泛应用。黄芩苷(Baicalin,C2iH18o11)是一种存在于黄芩植物根茎叶中的主要黄酮类化合物。研究表明黄芩苷具有调节机体免疫的功能,通过激活自身免疫系统的免疫识别和杀伤,攻击和清除肿瘤细胞。因此,黄芩苷在肿瘤化疗与免疫治疗方面具有广阔的应用前景。然而黄芩苷为难溶性药物,溶出速率慢,导致机体吸收差、生物利用率低,限制了其临床应用。为了增加药用植物资源临床应用,改变药物应用方式是一种理想的解决办法目前,纳米药物递送系统是实现药物高效利用的有效方法,通过仿生修饰和靶向设计等可延长药物体内循环时间,并提高药物在肿瘤部位的蓄积,降低药物的毒副作用,减少药物用量,提高药物利用率。因此,本研究拟构建一种共载黄芩苷联合免疫增强剂的多功能聚合物纳米粒,充分发挥黄芩苷肿瘤杀伤化疗及免疫治疗双重功效,提高黄芩苷在抗肿瘤治疗中的应用效率;在此基础上,进一步构建靶向肿瘤部位的载黄芩苷纳米粒,改善肿瘤免疫微环境,并借助黄芩苷的细胞毒性作用,在体内外形成免疫治疗和化疗的联合抗肿瘤效应,为提高药用植物活性成分利用率提供了新的思路。具体研究分述如下:1、通过优化参数条件构建了一种载黄芩苷的小粒径PLGA纳米粒(PLGA-B)。制备的载黄芩苷PLGA纳米粒呈球形、表面光滑、粒径在120 nm左右,具有较窄的粒径分布和良好的多分散性(PDI:0.103)。体外细胞实验表明,黄芩苷和载黄芩苷PLGA纳米粒可激活树突状细胞(DCs),增加DCs表面标志分子和共刺激分子的表达。此外,黄芩苷和载黄芩苷PLGA纳米粒可阻滞肿瘤细胞周期在G2/M期,导致肿瘤细胞凋亡。这些结果表明载黄芩苷PLGA纳米粒具有激活免疫细胞和诱导肿瘤细胞凋亡的双重功效。2、为了增强PLGA-B纳米粒的免疫激活能力,在PLGA-B纳米粒的基础上,构建了共包埋黄芩苷和肿瘤抗原(Hgp 10025-33,Hgp)、且表面偶联免疫增强剂(CpG)的PLGA纳米颗粒,在纳米粒表面进一步包裹半乳糖插入的红细胞膜,赋予纳米粒仿生长循环和靶向肿瘤部位的能力。细胞实验结果表明,小粒径仿生纳米粒增加了体外细胞对药物的摄取,促进了肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)表型逆转。动物实验研究发现,与载黄芩苷的PLGA-NPs(B@NPs)相比,半乳糖插入的红细胞膜修饰的仿生纳米粒NPs@RBC-Gala有效靶向肿瘤部位,并被高表达半乳糖凝集素的M2-TAMs摄取,显著逆转了体内肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的表型,由促肿瘤M2型向抗肿瘤M1型转变;研究也发现,在仿生纳米粒诱导下,抗肿瘤免疫细胞CD4+T和CD8+T淋巴细胞向肿瘤部位的浸润明显增加,显示免疫激活效应和T细胞反应显著增强,有效抑制了黑色素瘤在体内的生长,抑瘤率达到了65.7%。这些结果表明靶向肿瘤部位的仿生PLGA纳米颗粒可以靶向肿瘤部位,激活抗肿瘤免疫反应,实现抗肿瘤效应的提升。3、为了进一步研究共加载黄芩苷、CpG和黑色素瘤抗原肽片段Hgp25-33的复合纳米粒对肿瘤微环境的影响,进一步在其表面成功偶联修饰了 M2-TAMs的靶向肽(M2pep和α-pep肽),构建了双重靶向M2-TAMs的载黄芩苷复合纳米粒,标记为B/H@NPs@CpG-αmp。靶向M2-TAMs 载黄芩苷复合纳米粒(B/H@NPs@CpG-αmp)具有很好的粒径分布和PBS储存稳定性,其粒径为123.6 nm,小粒径有利于细胞摄取;在酸性环境下黄芩苷、Hgp和CpG可从复合纳米粒中持续释放7天,释放率均大于80%;细胞实验表明,M2pep和α-pep肽增强了复合纳米粒对肿瘤微环境中M2-TAMs的靶向能力,体外有效诱导M2型巨噬细胞表型逆转;靶向M2-TAMs载黄芩苷复合纳米粒与巨噬细胞联合应用显示了比较好的的体外抗肿瘤效果,肿瘤细胞凋亡比例最高为69.72%,这为体内动物抗肿瘤实验奠定了基础。4、为了检测双重靶向M2-TAMs的载黄芩苷复合纳米粒(B/H@NPs@CpG-αmp)是否有效靶向肿瘤微环境中M2-TAMs,刺激M2-TAMs表型逆转,改善肿瘤微环境,进一步研究了双重靶向M2-TAMs的载黄芩苷复合纳米粒(B/H@NPs@CpG-αmp)的体内抗肿瘤机制。动物实验结果表明,双重靶向M2-TAMs载黄芩苷复合纳米粒体内有效靶向M2-TAMs,在酸性溶酶体环境中可引起纳米粒表面聚多巴胺的裂解,复合纳米粒中黄芩苷等细胞毒素和免疫调节剂缓慢释放。黄芩苷和CpG的释放逆转了 TAMs表型,由促肿瘤M2型到抗肿瘤M1型,诱导M1型TAMs共刺激分子CD86的表达,表达量提升至38.42%,M2型TAMs共刺激分子CD206的表达量大大降低(仅为6.03%),促进了 TAMs释放应激细胞因子IL-12、IL-2和IFN-γ,活化的TAMs也将抗原呈递给T细胞,进一步刺激了 T淋巴细胞的抗肿瘤反应;此外,黄芩苷释放对局部黑素瘤细胞也具有杀伤作用,同时还改善了肿瘤微环境,促进T细胞、NK细胞在肿瘤部位的浸润。肿瘤冷冻切片中显示Th1细胞、CTL和NK细胞在肿瘤部位的浸润分别达到了 21.2%、24.93%和25.38%,黄芩苷还可有效抑制肿瘤血管生成,抑制肿瘤细胞转移;靶向M2-TAMs修饰的载黄芩苷复合纳米粒B/H@NPs@CpG-αmp表现出很强的抗肿瘤作用,体内肿瘤抑制率达到73.5%。这些结果表明靶向M2-TAMs修饰的载黄芩苷复合纳米粒改变了肿瘤微环境,由促肿瘤发生发展微环境重塑为抗肿瘤微环境,肿瘤微环境的改变是抗肿瘤治疗过程中至关重要的阶段。综上所述,本论文成功构建了共携载肿瘤抗原和免疫刺激剂的载黄芩苷PLGA纳米粒,纳米粒有效靶向肿瘤部位,并有效逆转TAMs表型,通过招募免疫细胞杀伤肿瘤细胞,同时传递化学活性药物,实现双重协同作用,重塑抗肿瘤微环境,达到高效抗肿瘤的目的。体内肿瘤治疗结果表明,构建的新型载低剂量黄芩苷复合纳米粒递送系统发挥了良好的增强抗肿瘤化疗与免疫治疗效应,提高了黄芩苷的抗肿瘤应用效率,提升了黄芩药用植物的资源利用价值,也为开发安全有效的抗肿瘤递送系统提供了新思路。