论文部分内容阅读
神经损伤类疾病的治疗一直是困扰医学界的一大难题。目前，治疗神经损伤类疾病的方法大体包括细胞的替代治疗和改善神经受损后局部抑制性的微环境两个方面。由于中枢神经系统神经元损伤后再生失败的原因错综复杂，上述治疗手段的效果往往不能从根本上解决问题。因此，阐明神经元内在再生能力的机制，探究神经损伤轴突再生的相关通路仍然是神经损伤类疾病治疗的关键。本实验通过体外诱导SH-SY5Y细胞分化，使其具有成熟神经元的特征，从而用作本研究的体外神经细胞模型。通过用RNA干扰技术下调分化SH-SY5Y细胞中PTEN基因表达，从而使mTOR通路激活，检测相关CD44分子表达是否上调及其与轴突生长的内部联系，进一步探讨mTOR通路是否通过CD44分子促进轴突生长，进而提高神经元的再生能力。方法：体外培养SH-SY5Y细胞，并用10μM全反式维甲酸(RTRA)诱导分化3d，用倒置显微镜观察诱导组SH-SY5Y细胞形态变化情况，并设立对照组。利用RT-PCR及免疫组织化学染色技术检测实验诱导组与对照组SH-SY5Y细胞微管相关蛋白(Microtubule associated protein MAP2)表达及转录情况，进而验证实验组与对照组细胞分化程度的差异；随后对分化成熟的细胞进行PTEN RNAi实验，利用荧光显微镜对各实验组细胞进行观察，检测实验干扰组的荧光转染效率；利用RT-PCR技术对干扰24h后各实验组细胞PTEN的转录水平进行检测；利用western blot技术对干扰36h后磷酸化核糖体(Ps6K)蛋白与雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达水平进行检测；利用RT-PCR技术检测CD44转录水平，并与对照组进行比较，观测CD44表达水平与轴突生长关系是否呈现正相关；将诱导后的细胞同时进行PTEN与CD44基因的共同干扰，并观察两种基因转录共同下调后，细胞轴突的长度变化情况。结果： RT-PCR结果证实诱导3d的细胞与对照组相比较，MAP2的转录水平明显上调。免疫组织化学方法证实，诱导3d的细胞与对照组相比较MAP2阳性细胞数明显增加。随后我们用RNAi技术对诱导分化的SH-SY5Y细胞进行PTEN基因干扰，24h后用RT-PCR技术检测PTEN基因的转录水平，与对照组相比，其转录水平明显下调。36h后我们再次检测干扰后细胞的mTOR与Ps6K蛋白的表达水平，与阴性对照组和空白对照组相比，其蛋白表达水平明显上调，差异显著（p<0.05）。干扰PTEN基因24h之后，发现实验组CD44转录水平上调，与阴性对照组和单纯诱导组相比差异显著（p<0.05）。随后利用imageproplus6.0分别对各实验组细胞进行轴突长度测量，并将各组数据分别进行统计学分析。结果表明，实验干扰3d细胞的轴突长度明显长于单纯诱导组和阴性对照组细胞的轴突长度，差异显著（P<0.05），当PTEN RNAi与CD44RNAi共同干扰时，PTEN单纯干扰组细胞轴突长度明显长于共同干扰组和单纯诱导组细胞的轴突长度，差异显著（P<0.05）。结论：mTOR通路激活后通过CD44分子表达上调促进神经细胞突起生长，从而促进神经元的再生。