一、研究背景 自体皮源不足是影响大面积深度烧伤病人救治的一个难点。目前，除传统的自体皮片移植外，体外培养扩增自体表皮细胞是提供永久性皮源的唯一方法。自Rheinwald等建立表皮细胞培养技术以来，表皮细胞膜片移植已应用于临床，但仍存在许多问题。如原代培养周期一般为10天左右，待细胞完全融合后才能使用，而此时的细胞增殖潜力已明显降低；膜片太薄，只有3～4层细胞，不易操作；细胞膜片消化困难，易损伤基底细胞锚着纤维，膜片移植后与创床的粘附能力差，影响基底膜的形成。其中最大的缺陷还是表皮细胞培养的时间不能随创面的变化而改变，往往创面情况良好，适合移植时，细胞尚未增殖融合成片；或待细胞融合成片时，创面可能发生感染而恶化，不适于膜片移植。细胞悬液移植的时机则不受此严格限制：原代、继代培养或处于亚融合、融合状态的细胞皆可用于悬液移植，及时封闭创面。国外在七十年代曾开展表皮细胞悬液移植，但因单纯细胞悬液的流动性大，滴加于创面后易流失，故未能为临床提供可行的方法。后采取细胞悬液与纤维蛋白原、凝血酶原以及Ca²⁺结合，呈凝胶状应用于创面。纤维蛋白原、凝血酶原均为创面止血成分，因而用于创面又可止血。然而纤维蛋白原来源困难，成本高，而且由于是血制品，难以排除传染性病毒污染的可能，从而限制了其在临床的应用。 早期，表皮细胞悬液移植应用于深度烧伤创面，由于缺乏真皮组织，创面愈合后疤痕增生明显，反复形成水疱、破溃，影响愈合后的功能与外观。后采用异体皮拉网，细胞悬液滴入网状孔隙中，一定程度上改善了移植效果，但创面愈合后瘢痕增生仍较明显，而且异体皮不能排除传染性病毒污染的危险。本实验选择透明质酸钠（sodium hyaluronate，简称SH）与表皮细胞悬液混合，降低了细胞悬液的流动性，使细胞滴加于创面后与创面粘附紧密，不易流失，而且外源性透明质酸（Hyaluronic 第二军医大学 中文摘要 硕士学位论文 acid，简称HA）可作用于创面，抑制创面炎症反应，促进成纤维细胞迁移，抑制创口 收缩和1型胶原过度沉积所造成的派痕异常增生，促进创面愈合。同时以自制的海 绵状胶原膜为真皮支架，结合细胞悬液移植，以期及时封闭创面，并改善创面愈合 质量。 ＿、研究目的 1．筛选合适浓度的SH作为表皮细胞悬液移植的基质； 2．探讨海绵状胶原膜作为真皮支架的可行性； 3．探讨表皮细胞悬液结合海绵状胶原膜进行移植的可行性，为临床应用提供依 据。 三、研究内容与方法 第一部分：SH基质的筛选 筛选SH基质的要求：粘附性大，保证细胞悬液滴加于创面不流失；对表皮细 胞的生长无明显抑制作用。以含不同浓度SH的DMEM（Dulbecco七 Modified Eagle Medium）完全培养基培养表皮细胞48或72 ／J’时；采用XTT试剂盒，用酶联免疫 吸附法测定样品的光吸收值，了解SH对表皮细胞增殖活性的影响，并结合SH溶液 的粘滞性，挑选出合适浓度的SH基质。 第二部分：海绵状胶原膜的制备 以酸溶法制备胶原溶液，滴加6－硫酸软骨素C，冻干成膜，0．25％戊二醛溶液交 联。将制备的胶原膜包埋于SD大鼠皮下，定期取材以检测其组织相容性、血管化 能力及降解速度。 第三部分：表皮细胞种植于海绵状胶原膜的体外培养实验 取正常人包皮环切术切下的皮肤分离表皮细胞，体外种植于海绵状胶原膜上， 置37C、5％CO。孵育箱培养，观察细胞生长增殖情况。 第四部分：表皮细胞悬液结合海绵状胶原膜移植的动物实验 2 第二军医大学 中文摘要 硕士学位论文 将胶原膜移植于裸鼠全层皮肤缺损创面，同时或待一周左右胶原膜血管化后滴 加表皮细胞悬液，观察创面愈合情况。对照组为无胶原膜的单纯表皮细胞悬液移植。 四、研究结果 第一部分：0．7％浓度的SH具有一定的粘滞性，且对表皮细胞的生长及增殖无 明显抑制作用，为最适的表皮细胞悬液移植基质。 第二部分：制备的海绵状胶原膜，胶原纤维排列成网状。皮下埋藏实验表明组 织相容性较好，无急性排斥反应，血管化能力强，降解速度慢，真皮构架稳定性好。 第三部分：胶原膜对表皮细胞无明显毒性作用。在胶原膜上种植人表皮细胞， 表皮细胞生长增殖较好，2－3周可形成复层细胞膜片。 第?