文昌鱼(Amphioxus)属于文昌鱼纲-头索动物亚门仅有的一个纲，现存动物仅29种左右。分布于我国的文昌鱼主要是白氏文昌鱼(BranchiostomabelcheriGray)，分为青岛亚种和厦门亚种。 文昌鱼的传统分类地位比较特殊，在生物进化中占有重要的地位。文昌鱼是否是最接近于脊椎动物的无脊椎动物，存在着两种不同的观点。 一种观点认为，文昌鱼是全世界现存动物中最接近于脊椎动物的无脊椎动物，脊椎动物的祖先生物可能与文昌鱼类似。支持这一观点的人居多，主要依据是：首先，从结构上、形态上文昌鱼更像鱼，文昌鱼的身体构造和脊椎动物非常相似，具有脊索、神经管、咽鳃裂等脊索动物的三大基本特征，而且还有体节和肌节。其次，对文昌鱼神经内分泌和生殖内分泌的研究也支持这种观点，文昌鱼的哈氏窝(Hatschekspit)是文昌鱼的高级内分泌调节中枢，与脊椎动物下丘脑的内分泌功能类似。再次，对文昌鱼基因进化的许多研究也支持这一观点。文昌鱼AmphiD1/beta，HOX1，HOXb1，HOX3等基因与脊椎动物的同源基因同源性很高，功能上亦有很大的相似性。 另一种观点认为，文昌鱼不是与脊椎动物祖先生物最接近的动物，尾索动物即被囊动物更接近于脊椎动物的祖先。支持这一观点的认为“从基因组研究看来，脊椎动物的祖先是被囊类动物(tunicates)，而不是文昌鱼(Amphioxus)。被囊类动物更接近于脊椎动物；文昌鱼既不接近于被囊动物，也不接近于脊椎动物，而是更接近于棘皮动物(echinoderms)。”上述两种观点虽然不同，但有一点是相同的，即都希望通过基因进化的研究确定脊椎动物的起源。因此，积极开展文昌鱼基因进化的研究是很有必要的。 近些年来我们主要开展了文昌鱼发育分子机制的研究，发现了一批与文昌鱼胚胎发育调控机制有关的基因，包括：Hedgehog，AmphiCKS1，AmphiSom,AmphiMdp，profilin，GABARAPL2,AmphiHMGB，thymosin-beta4等。本研究将报道的AmphiTCTP,AmphiG10基因和文昌鱼核糖体蛋白基因也是这项研究工作的一部分。 TCTP基因是翻译控制肿瘤蛋白(translationallycontrolledtumourprotein，TCTP)的编码基因。TCTP蛋白又称P21，Q23或P23最早被认为是一个腹水瘤相关蛋白，后来发现TCTP同源基因在绝大多数哺乳动物的肿瘤组织、正常组织和细胞系中均有表达。TCTP在细胞生长、细胞周期运行、癌变、抗凋亡、甚至在过敏性鼻炎、哮喘、先天性慢性风疹有重要作用。TCTP也是一种组织胺释放因子，并可与微管蛋白和钙离子结合。 通过建文昌鱼神经胚cDNA文库和规模化测序，我们筛选到编码TCTP同源的文昌鱼TCTP，此cDNA全长697bp，阅读框位于35-544bp，由510核苷酸组成，所编码169aa的TCTP蛋白。blast分析表明，此cDNA的演绎蛋白与其他物种的TCTP有很高的同源性，同源性在40﹪-57﹪之间。其他物种的TCTP蛋白含有两个特征性氨基酸序列TCTP1和TCTP2，本研究发现文昌鱼TCTP同样含有TCTP1和TCTP2特征性氨基酸序列，分别处于46-56和126-148氨基酸序列段，因此，命名该基因为AmphiTCTP(GenBankaccessionnumber：AF397146)。系统进化树分析显示，AmphiTCTP演绎蛋白在进化上是相当保守的。AmphiTCTP演绎蛋白更接近于脊椎动物TCTP，其进化枝在脊椎动物TCTP进化枝基部分开，显示文昌鱼TCTP基因的进化性与文昌鱼在动物的系统分类中的进化地位相一致。通过整装原位杂交技术和切片技术对文昌鱼胚胎发育不同时期体内AmphiTCTP表达状况进行了研究，结果显示AmphiTCTP在受精卵和早期分裂球中有表达，在进入囊胚和原肠胚时期未见表达。但在受精后10h发育的早期神经胚的背中部重新表达。切片观察显示表达区位于正在分化的体轴和近旁中胚层。随着胚胎的发育，AmphiTCTP在预定脊索中胚层、预定体节中胚层和初生的体节中表达。但随着脊索和体节的形成，AmphiTCTP在这些区域的表达将下降。在外胚层和内胚层及其形成的组织中未见AmphiTCTP的表达。AmphiTCTP的这种随着文昌鱼胚胎发育的进行在不同区域表达的模式，提示我们AmphiTCTP是文昌鱼脊索和体节形成相关的基因。Northernblotting和RT-PCR分析进一步验证了原位杂交的结果。Northemblotting采用12h和18h发育时期的胚胎，杂交结果均呈一条杂交带。RT-PCR采用1h,4h，9h,16h发育时期的胚胎。均有一条PCR产物带，但在4h发育期的PCR产物很少。Northernblotting和RT-PCR的实验结果与原位杂交结果是一致的。我们的实验证实在受精卵内存在大量的AmphiTCTPmRNA，说明AmphiTCTP是一个母源性基因。受精四小时的胚胎整装原位杂交实验结果和RT-PCR结果略有差异，说明这一时期的胚胎AmphiTCTPmRNA含量已经很少，母源性产物己消耗殆尽，而胚胎自身尚未表达或即将表达，因此原位杂交实验已检测不到AmphiTCTP的存在，但RTPCR尚能检测到微量的AmphiTCTP存在。 G10蛋白是最早发现于爪蟾卵母细胞质中的一种母源性物质，是一个转录调控因子在卵母细胞质中存在的母源性G10mRNA，在卵子减数分裂完成时或受精后的特定时期表达。现已发现爪蟾G10基因的同源物广泛地存在于各种生物。我们随机筛选的文昌鱼TCTP同源基因cDNA序列全长693bp，开放阅读框为62-496bp，尾随序列为497-603bp.尾随序列中含有poly(A)尾部，AATAAA的加尾信号以及TATA框，显示典型的脊椎动物的mRNA的特征.演绎蛋白由144aa组成。 G10与人、大鼠、牛、鸡、壁虎、爪蟾、斑马鱼、吴郭鱼、黑青斑河豚等脊椎动物的G10同源性高达86-92﹪，与海胆G10同源性为93﹪，与家蚕、果蝇的G10同源性为90-92﹪,与线虫的G10同源性高达72﹪，与恶性疟原虫和酵母等低等物种的G10同源性分别为57-59﹪外。 氨基酸序列矩阵分析显示，AmphiG10亦有3个特定的氨基酸序列段，分别是N端1-10位的氨基酸构成一个特定的NTS信号(nucleartranslocationsignal，NTS)，14-38位酸性氨基酸交替出现构成特定的酸性氨基酸区(AcidicDomain)，第三个结构域在富含半胱氨酸的C端，101-119位氨基酸序列含有典型的C2-C2锌指结构域(ZincFinger)。说明G10是一类金属依赖性核调节蛋白。AmphiG10可能是文昌鱼卵裂细胞增殖的核功能调控因子。对AmphiG10演绎蛋白的系统进化树分析显示，尽管G10蛋白在进化上非常保守，随着动物的进化也发生相应的微弱改变。AmphiG10演绎蛋白与海胆的G10共处于一个分枝，在脊椎动物G10进化的基部与昆虫类动物平行分开。表明AmphiG10演绎蛋白的进化与文昌鱼本身的动物进化地位基本一致。 核糖体是合成蛋白质的细胞器。组成真核生物细胞质核糖体的蛋白有82种，其中49种是大亚基蛋白，33种是小亚基蛋白质，这些蛋白不仅与rRNA结合构成核糖体的大亚基和小亚基，而且具有多酶复合体的特征。随着生物的进化，生物体内的基因也在发生着相应的改变，从而产生了物种的多样性和蛋白、基因的多样性。因此，细胞质核糖体发生相应的改变就在所难免。系统地进行核糖体蛋白的进化分析，找到适合动物进化研究的核糖体蛋白分子标签(molecularmarker)，从而有可能把分析核糖体蛋白及其编码基因的序列作为鉴定物种的有效工具，正是本研究开展核糖体蛋白分析的主要目的。 通过规模化测序，得到64种文昌鱼核糖体蛋白cDNA序列，其中60S大亚基的蛋白35种，40S小亚基的蛋白29种。具有完整阅读框的基因大亚基有18个，分别是L9,L11，L12，L15,L18,L22,L23a,L24,L26,L27,L30,L35,L36,L37a,L38,L39,P1，P2；小亚基也有17个，分别是S4,S6,S7,S10,S12,S13，S15a,S16,S17,S18,S19,S21，S23，S25,S27a,S28,S30.本研究对33种核糖体蛋白开展了基因序列分析、蛋白二级结构分析、蛋白氨基酸序列的同源性分析和蛋白系统进化树的分析四个方面的研究。 通过系统进化树分析，我们将文昌鱼的核糖体蛋白进化树分成五种类型，即点辐射型、节肢动物分枝偏向型、脊椎动物分枝偏向型、过渡型和原始型。根据各类型的特点将文昌鱼核糖体蛋白进行了归类。由于文昌鱼的核糖体基因大多数具有脊椎动物的结构特点，大多数核糖体蛋白与脊椎动物的同源蛋白的同源性高于其它物种的同源蛋白，因此我们判定脊椎动物分枝偏向型和过渡型各一部分核糖体蛋白可以作为动物系统进化的分子标签，这些蛋白包括：通过脊椎动物分枝偏向型进化树筛选的核糖体蛋白L26，L27,S4，S12，S18,S27a和通过过渡型进化树选出的核糖体蛋白L15，L22，L23，L30，L35，P1，S19，S25a。