论文部分内容阅读
研究表明,动物卵泡的生长发育和成熟及其独特的等级排卵是在生殖激素和一系列生长因子的精确调控下进行的,EGF作为一种关键的生长因子参与了鸡、人及大鼠等动物原始卵泡的生长启动以及卵泡发育、成熟的调节。而鹅作为一种产蛋量低,且呈季节性繁殖的家禽,其卵泡的生长发育和成熟是否也受生殖激素和一系列生长因子调节,目前尚未见有报道。本研究在开展鹅卵泡发育过程形态组织学研究的基础上,深入探讨了EGF参与FSH介导鹅颗粒细胞增殖的作用机制。为探讨鹅卵泡发育过程中各级卵泡形态结构变化,通过组织形态学方法对鹅卵泡发生发育过程中形态学变化进行了研究。与开产前期相比,产蛋期鹅卵巢重量迅速增加,生长有5或6个等级卵泡(依体积从大到小命名为F1、F2...F5或F6)和等级前卵泡(SWF、LWF、SYF、LYF)。进入就巢期后不同等级的卵泡出现闭锁,卵泡基本停止发育,卵巢出现萎缩和退化。透射电镜观察结果显示,就巢鹅闭锁卵泡边界不清晰,失去完整结构。在产蛋期内,LYF颗粒细胞厚度达22.18μm,当进入等级发育后颗粒细胞厚度变薄,F1时期颗粒细胞厚度仅为12.53 μm；在等级前卵泡阶段,膜细胞层缓慢增厚,SWF时期膜层厚度仅为40.61μm,进入等级发育以后膜细胞层厚度迅速增加,F4时期达到308.30μm,增加到原来的7.7倍。采用酶联免疫法(ELISA)对各级卵泡内激素及生长因子含量进行测定,发现在卵泡发育过程之中FSH出现了2个峰值(SYF、F2时期的FSH浓度分别为59.24 mIU/mg、46.06 mIU/mg), LH也与FSH表现出相似的趋势,但在LYF、F4时期出现峰值；而P4和E2在卵泡等级发育过程中呈现出下降的趋势,且在LWF、SWF时期明显高于其他时期(P<0.05)。对各级卵泡的EGF含量进行测定,结果表明在卵泡由等级前向等级卵泡发育过程中,在SYF和LYF时期显著高于其他发育时期(P<0.05),分别达68.65 pg/mg和46.73 pg/mg。实时荧光定量PCR检测结果显示,EGF及其受体EGFR在SYF时期相对表达量最高,分别为F1时期的10.17倍和5.87倍,总体表现为先上升后下降的趋势。由上可以看出,在鹅卵泡发育过程中,其形态结构、FSH与LH等生殖激素以及EGF含量发生了显著变化,其中SYF时期是发生变化的关键阶段。为进一步阐明EGF和FSH对鹅等级前卵泡发育及卵泡颗粒细胞增殖的调控作用。通过选取SYF分离颗粒细胞培养,比较不同浓度EGF (0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL)和FSH (0 mIU/mL、25 mIU/mL、50 mIU/mL和100 mIU/mL)对鹅颗粒细胞的影响,结果发现,EGF和FSH联合作用对鹅等级前卵泡颗粒细胞有促增殖作用,在EGF(浓度为10 ng/mL)和FSH(浓度为50 mIU/mL)共同处理下,颗粒细胞增殖效果显著(P<0.05)。分离鹅等级前卵泡进行体外悬浮培养,经EGF (10 ng/mL)和FSH (50 mIU/mL)单独或者共同处理24 h后,颗粒细胞层和膜细胞层均增厚,当两者共同处理时,SYF颗粒细胞层厚度和膜细胞层厚度分别增加4.16 μm,8.36 μm (P<0.05)。同时还发现在EGF和FSH共同作用下,颗粒细胞中抗凋亡基因Bcl-2表达量上升12倍(P<0.05),促凋亡基因Bax表达量下降了3倍(P<0.05)。由此可以看出,EGF可促进鹅卵泡颗粒细胞的增殖,抑制细胞凋亡,而且在FSH存在的情况下,这种作用进一步加强。为探讨EGF对参与颗粒细胞凋亡关键基因Smad4表达水平的影响,首先克隆了鹅Smad4基因(Genbank登录号：KU363745),发现了其一种可变剪接形式Smad4-b (Genbank登录号：KU363746),经过比对,发现第5外显子完全缺失。RT-qPCR检测显不,Smad4基因的2种剪接形式在下丘脑,垂体,卵巢,输卵管等繁殖组织中都有表达,并以Smad4-a(野生型)为主(P<0.01),且组织丰度依次为：输卵管>卵巢>垂体>下丘脑。颗粒细胞经EGF处理后,Smad4-a的表达显著下调(P<0.05)。为进一步探讨产蛋鹅与就巢鹅卵巢miRNA对颗粒细胞增殖的影响。选取产蛋期和就巢期鹅卵巢基质组织,采用Solexa深度测序技术对产蛋鹅和就巢鹅卵巢组织差异miRNA进行测序,共获得了353条差异表达的miRNA,相对于产蛋鹅卵巢,有127条miRNAs在就巢鹅卵巢表达上调,126条miRNAs表达下调。GO注释和KEGG通路分析显示,差异表达的miRNA参与了激素的分泌、再生过程等生物学过程。RT-qPCR检测结果显示,经EGF或FSH处理后,miR-26b、miR-27a、miR-27b等miRNA表达均显著上调(P<0.01), miR-22、miR-27c、miR-34基因表达下调。差异miRNA靶基因预测发现,Smad4即为miR-26b候选靶基因之一,趋势与miR-26b相反。推测EGF参与鹅颗粒细胞增殖很可能依赖于miR-26b靶向于Smad4来实现的。上述结果表明,以上关键miRNA在EGF介导的颗粒细胞增殖的过程中发挥了一定作用。总之,本研究分析了产蛋鹅卵巢卵泡发育的形态学图谱,测定了卵泡内关键激素以及因子的浓度,探究EGF和FSH互作对鹅体外培养卵泡以及颗粒细胞的作用,并探讨了EGF参与卵泡颗粒细胞凋亡关键基因Smad4及关键候选miRNAs表达调控研究,上述研究结果将有助于全面了解EGF参与鹅生殖调控过程分子机制,为未来提高鹅繁殖力,壮大鹅产业提供一定的理论支撑。