目的失眠是严重影响人们身心健康的精神疾病之一,常伴有抑郁情绪。柴胡加龙骨牡蛎汤是治疗失眠的经典方剂,其作用机制尚未完全阐明。本研究拟以睡眠剥夺大鼠为研究对象,从脑-肠-菌群变化探讨其作用环节,为中医药防治失眠提供基础理论依据。方法将70只SPF级雄性大鼠(200±20g)随机分为空白组、模型组、柴胡加龙骨牡蛎汤加减(中药)低、中、高剂量组、地西泮组和草酸艾司西酞普兰(抗抑郁)组,每组10只。除空白组外,余组大鼠均用改良的多平台水环境法建立REM睡眠剥夺模型,并用戊巴比妥钠睡眠协同实验评价模型是否成功建立。大鼠造模结束后,地西泮组灌胃地西泮片,剂量为0.45 mg/(kg·d),抗抑郁组灌胃草酸艾司西酞普兰片,剂量为0.9mg/(kg·d),中药低、中、高剂量组灌胃柴胡加龙骨牡蛎汤加减方,剂量分别为中药低剂量组5.8 g/(kg·d)、中药中剂量组11.6g/(kg·d),中药高剂量组23.2g/(kg·d),空白组和模型组灌胃等体积生理盐水,每日1次,根据预实验结果选择连续灌胃2周后为观察时间点,进行如下检测:1.利用戊巴比妥钠睡眠协同实验评价各组大鼠的睡眠潜伏时间及睡眠持续时间;2.应用行为学测试(包括旷场试验、蔗糖水偏好试验)评价各组大鼠的行为学表现;3.应用ELISA法检测各组大鼠血清中5-HT、NE含量;4.采集各组大鼠粪便,每只鼠至少取得一粒成形粪便,采集完毕后统一送检,利用高通量测序技术检测肠道菌群的种类及丰度。结果1戊巴比妥钠睡眠协同实验结果经3周睡眠剥夺后,有13只大鼠翻正反射未消失,余下睡眠剥夺大鼠与未剥夺睡眠大鼠相比,睡眠潜伏时间延长、睡眠持续时间缩短(p<0.01,p<0.01)。连续灌胃2周后,地西泮组有2只大鼠翻正反射未消失。睡眠潜伏时间:模型组较空白组延长(p<0.01);中药中剂量组较模型组缩短,较中药低剂量组缩短(p<0.01,p<0.05);中药高剂量组、地西泮组、抗抑郁组较模型组缩短(p<0.05)。睡眠持续时间:模型组较空白组缩短,中药中、高剂量组较模型组延长(p<0.05,p<0.05)。2行为学测试结果模型组水平、水平加垂直分数低于空白组(p<0.01,p<0.01);中药中、高剂量组的水平、水平加垂直分数高于模型组(p<0.01,p<0.01);中药低中高治疗组之间,中药治疗组与地西泮组、抗抑郁组之间的差异无统计学意义(p>0.05)。模型组糖水偏好率较空白组降低,各治疗组糖水偏好率较模型组均升高,差异无统计学意义(p>0.05)。3血清学结果5-HT、NE:模型组、中药低、高剂量组较空白组低(p<0.01)。各治疗组较模型组升高,其中中药中剂量组、地西泮组、抗抑郁组与模型组之间的差异有统计学意义(p<0.01)。中药中剂量组较低、高剂量组高,且低、中剂量组之间的差异有统计学意义(p<0.01)。4高通量测序结果4.1各组大鼠肠道菌群多样性的情况Alpha多样性:observed_otus指数、chao1指数:模型组、中药低剂量组、地西泮组、抗抑郁组较空白组大,中药中、高剂量组较空白组大(p<0.01,p<0.05)。ACE指数:模型组及各治疗组较空白组大(p<0.05)。shannon指数:模型组、地西泮组、抗抑郁组较空白组大,中药低、高剂量组较空白组大(p<0.01,p<0.05)。simpson指数:模型组、抗抑郁组较空白组大,地西泮组较空白组大(p<0.01,p<0.05)。Beta多样性:Bray Curtis距离有显著差异者:空白组与其余各组,模型组与中药低、中、高剂量组、抗抑郁组,中药低剂量组与中剂量组、地西泮组、抗抑郁组,中药中剂量组与高剂量组、抗抑郁组,中药高剂量组与地西泮组、抗抑郁组,地西泮组与抗抑郁组。Unweighted Unifrac距离有显著差异者:空白组与其余各组,模型组与中药高剂量组,中药低剂量组与高剂量组、抗抑郁组,中药中剂量组与抗抑郁组,中药高剂量组与地西泮组、抗抑郁组。Weighted Unifrac距离有显著差异者:空白组与模型组、中药低、高剂量组、地西泮组、抗抑郁组,中药中剂量组与抗抑郁组,中药高剂量组与地西泮组、抗抑郁组。4.2各组大鼠的特征菌群门水平:模型组大鼠的特征菌群为蓝藻门、软壁菌门、疣微菌门,此三者可助眠。属水平:空白组的特征菌群为寡源杆菌属,它包括尿道寡源杆菌和解尿寡源杆菌,前者是泌尿生殖系统的共生菌,很少致病,后者也寄居在尿道,与长期使用导尿管、尿道阻塞有关;模型组的特征菌群为艾克曼菌属、棒状杆菌属、费克蓝姆菌属、瘤胃球菌属,其中艾克曼菌属、棒状杆菌属可改善抑郁,费克蓝姆菌属、瘤胃球菌属与睡眠限制有关;中药低剂量组的特征菌群为Dorea菌属、栖粪杆菌属,此二菌可减少炎症反应;中药中剂量组的特征菌群为肠球菌属、孪生球菌属,二者皆能改善抑郁,且肠球菌属有助眠作用;中药高剂量组的特征菌群为布劳特氏菌属、粪球菌属、柯林斯氏菌属、厌氧棒状菌属、霍尔德曼氏菌属,其中厌氧棒状杆菌属可改善抑郁,霍尔德曼氏菌属与觉醒次数呈负相关,余者皆与高质量睡眠呈负相关;抗抑郁组的特征菌群为拟杆菌属、副拟杆菌属、罗氏菌属、Defluviitalea菌属、梭状芽孢杆菌属,它们与抑郁、失眠呈正相关。4.3优势菌群在各组大鼠中的相对丰度比较有显著差异的菌门:厚壁菌门:中药中剂量组较模型组高,抗抑郁组较空白组、中药中剂量组低,较高剂量组低(p<0.01,p<0.01,p<0.05)。变形菌门:中药中剂量组较空白组、模型组高,较低剂量组低,中药高剂量组较中剂量组低,地西泮组较空白组、模型组高,较中药低、高剂量组高,抗抑郁组较中药中剂量组高(p<0.01,p<0.05,p<0.01,p<0.01,p<0.05,p<0.01)。蓝菌门:模型组较空白组高,中药高剂量组较模型组低,地西泮组较模型组低,抗抑郁组较中药高剂量组高,较地西泮组高(p<0.05,p<0.01,p<0.05,p<0.01,p<0.05)。有显著差异的菌属:乳杆菌属:模型组、中药低中高剂量组、地西泮组较空白组低,抗抑郁组较空白组低(p<0.05,p<0.01)。布劳特氏菌属:中药高剂量组较空白组高,抗抑郁组较中药高剂量组低,较地西泮组低(p<0.05,p<0.05,p<0.01)。栖粪杆菌属:中药低中高剂量组较模型组、抗抑郁组高(p<0.05)。阿洛巴氏菌属:抗抑郁组较空白组、中药中剂量组低(p<0.01)。颤螺菌属:中药高剂量组较模型组、地西泮组低,较抗抑郁组低(p<0.05,p<0.01)。瘤胃球菌属:地西泮组较空白组、中药中剂量组高,抗抑郁组较空白组高(p<0.05,p<0.05)。拟杆菌属:中药高剂量组较低剂量组低,较地西泮组、抗抑郁组低(p<0.05,p<0.01)。粪球菌属:抗抑郁组较模型组、中药中剂量组低,较高剂量组低(p<0.05,p<0.01)。Dorea菌属:抗抑郁组较空白组、中药低中高剂量组低(p<0.05)。普氏菌属:抗抑郁组较地西泮组低(p<0.05)。副拟杆菌属:地西泮治疗组较空白组高,较中药中高剂量组高,抗抑郁组较空白组、中药高剂量组高(p<0.01,p<0.05,p<0.05)。结论采用改良的多平台水环境造模法,进行为期3周的间歇性睡眠剥夺,可建立稳定的REM睡眠剥夺模型,中、高剂量的柴胡加龙骨牡蛎汤能改善失眠及其伴随的不良情绪,且两者之间无统计学差异(p<0.05),但仅中剂量组5-HT、NE水平较模型组显著升高,提示高剂量的柴胡加龙骨牡蛎汤存在其他途径发挥疗效。中剂量组主要增加改善失眠、调整情绪的菌群,高剂量组主要增加破坏睡眠、调整情绪的菌群,提示柴胡加龙骨牡蛎汤可通过增加改善失眠、抑郁的菌群产生疗效,但剂量加倍后效果并未提升,可能与随之增加的破坏睡眠的菌群有关。