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辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici)X2-3是本实验室从小麦根际土壤中分离得到的一株溶杆菌菌株,对多种植物病原真菌和卵菌具有明显的拮抗活性.该菌株菌落表面光滑,GC%含量高,具有很强的滑动性.本研究以L.capsici X2-3为出发菌株,构建了X2-3转座子随机插入突变体库,从突变体库中筛选生物膜表型变化的突变株,并对突变体MT4的相关基因功能进行了分析.取得的主要研究结果如下: 1.随机插入突变体库构建 利用Tn5随机插入法对X2-3进行转座诱变,获得了4800余个插入突变体.以生物膜表型特征为依据,筛选得到了7株生物膜表型变化的突变株,分别命名为MT1-MT7.通过质粒拯救法,确定了Tn5在不同突变体中插入的目的基因位点,其中3个突变株插入位点在同一个基因LC0409,其余4个突变体插入位点分别在基因LC3417,LC3753,LC4356和LC0306. 2.突变体MT4插入基因的功能预测 对突变株MT4插入基因在GenBank中比对分析,发现,该基因编码GntR家族转录调控因子,其氨基酸序列与辣椒溶杆菌L.capsici(ID:ALN83455)氨基酸序列相似性达到100%,与产酶溶杆菌L.enzymogenes(ID:WP_057949624)氨基酸相似性达到96%. 对MT4突变体生物学特性观测发现,MT4的生物膜产量明显低于野生株;以4种植物病原真菌为靶标,分析其拮抗活性,发现MT4的抑菌活性与野生株没有差别,说明生物膜的变化对抑菌活性没有影响. 3.回复突变体构建 提取野生株X2-3的基因组DNA,PCR法从X2-3中扩增到LC4356的完整ORF,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,连接到广宿主载体pBBR1MCS-5,电击法将重组质粒PBBR1-4356转入MT4突变体,经表型观察、分子生物学验证,获得回复株MCS-4356. 4.GntR家族基因LC4356对其上游基因的调节作用 荧光定量PCR法检测了野生株X2-3、突变体MT4和回复株MCS-4356中LC4356基因及其上游基因LC4357、LC4358、LC4359的表达量,结果发现MT4和MCS-4356菌株的LC4356基因及其上游基因的表达量均有明显变化. 5.突变体与野生株生物学特性分析 比较了野生株X2-3、突变体MT4及其回复株MCS-4356的生物学特性,发现,突变体的生长速度与野生株及回复株相比没有明显变化,但MT4的生物膜和胞外多糖产量均明显降低.菌落直径法测定了各菌株的运动能力,发现培养4d后,野生株、突变体及其回复株在NYGB培养基上的菌落直径分别为2.51cm,1.59cm和1.87cm,可见突变体的菌落明显小于野生株,回复株部分恢复了突变体MT4的运动能力. 6.突变体与野生株对环境的耐受性分析 从5个方面测定了突变体与野生株对环境的耐受性,结果发现,在不同NaCl浓度、pH和培养温度下,突变体MT4的生长速度与野生株没有明显的差别;但经不同浓度的SDS和紫外光处理后,突变体MT4的生长速度显著降低,表明突变体MT4对SDS和紫外光处理非常敏感,但对盐浓度、pH和培养温度等没有明显的改变.而回复株与野生株在5种条件下生长速度没有明显差别,表明回复株恢复了突变体MT4对环境的耐受性.