目的本项目前期研究数据证明,桑蚕蛹中的一种水溶性多糖(即PSP1)具有抑制宫颈癌He La细胞增殖的作用。本研究目的在于优化桑蚕蛹多糖的超声提取工艺,并对这种水溶性多糖的组分及结构进行分析。本实验采用薄层色谱法(TLC)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)对活性多糖进行组分分析;采用物理、化学及仪器分析等方法对其结构进行初步分析,并将其制成胶囊剂以供后续进行药动学和药效学研究。以求为天然抗肿瘤药物中有效成分的进一步开发与利用提供实验依据。方法传统的多糖提取工艺有水提醇沉、碱液提取以及微波提取等方法,通过查阅大量文献可知,采用传统的提取方法得到的多糖提取率并不高。因此,本研究在碱液提取的基础上,采用超声波法辅助碱液提取桑蚕蛹多糖,以优化桑蚕蛹多糖的提取工艺。已知超声波法提取桑蚕蛹多糖的得率与超声功率、超声时间、液料比三个因素有关。因此,在单因素实验的基础上,根据中心组合试验设计原理(Box-Behnken),并利用响应面分析软件Box-Behnken Design(BBD)模型,以功率(A)、时间(B)、液料比(C)三因素为自变量,多糖得率Y为响应值,设计三因素三水平的响应面实验,筛选超声波法提取桑蚕蛹多糖的最佳工艺条件。分析桑蚕蛹活性多糖PSP1的组分。本研究采用纸层析和紫外分光光度计对多糖纯度进行检测。在纯度合格的基础上,采用薄层色谱法对多糖组分进行分析,并进一步采用GC-MS方法对多糖组分进行确证。因多糖本身不具有挥发性,不能直接进行GC-MS分析,所以本实验在GC-MS进样前对多糖进行酸解及衍生处理。桑蚕蛹活性多糖PSP1的结构分析。本研究采用物理、化学、仪器分析等相结合的方法对桑蚕蛹中具有抗肿瘤活性的多糖PSP1的结构进行初步分析。分别采用:性状观察、化学定性实验、高碘酸钠氧化、Smith降解、红外检测、分子量测定等方法,并综合实验结果,对PSP1结构进行分析。水溶性桑蚕蛹多糖胶囊剂的制备。首先,从乙醇浓度、乙醇用量、干燥温度等方面进行制粒工艺条件的筛选;按照最佳制粒工艺条件进行胶囊剂的制备,并按照《中国药典》胶囊剂检查项下相关规定进行检查。结果超声波法优化桑蚕蛹多糖提取的最佳工艺为超声功率760 W,液料比11:1,超声时间10 min,此条件下多糖的平均得率为15.28%。在多糖PSP1纯度检验合格的基础上,采用薄层色谱法分析多糖组分可能为葡萄糖、山梨糖、半乳糖和甘露糖,采用气-质联用仪对多糖PSP1的组分进行进一步的分析和确证。将供试品各峰的保留时间与标准质谱尼斯特谱库(NIST)进行对照分析,可得知多糖PSP1中主要的单糖组分为葡萄糖、山梨糖、半乳糖和甘露糖,相对应的摩尔比为95.94:1.59:1.59:0.88。采用物理、化学、仪器分析等方法对其结构进行初步解析。化学定性实验说明该多糖中不含有还原性的糖、淀粉、蛋白质及其水解产物氨基酸等成分。结合高碘酸钠实验和Smith降解实验结果说明桑蚕蛹多糖PSP1中含有1→6糖苷键和1→2糖苷键,并且红外图谱显示PSP1具有典型的多糖特征吸收峰,同时含有吡喃糖结构,相对平均分子质量约为1.12×105 Da。通过实验得知:乙醇浓度90%、料液比1:1、干燥温度60℃为最佳制粒条件,在此条件下制备的胶囊剂符合《中国药典》胶囊剂检查项下相关规定。结论本实验采用超声辅助碱液提取的方法提取桑蚕蛹多糖,测得多糖平均得率为15.28%。经活性炭脱色,Sevag法除蛋白后,测定多糖含量为82.34%。采用柱层析的方法对多糖进行纯化,纯化效果较好,可得到均一组分的多糖。通过一系列的纯度检测,考察前期的分离、纯化结果是否理想,分析是否满足进一步分析的纯度要求。在满足条件的基础上采用薄层色谱法分析活性多糖PSP1组分,并采用GC-MS技术进一步确证多糖组分。最终确定桑蚕蛹活性多糖PSP1的单糖组分为葡萄糖、山梨糖、半乳糖和甘露糖,其峰面积百分比为95.94:1.59:1.59:0.88,进一步确证了薄层色谱法实验结果。通过物理、化学、仪器分析等方法对桑蚕蛹多糖PSP1的结构进行了初步分析。实验结果显示,多糖PSP1中糖苷键的链接类型为1→6糖苷键和1→2糖苷键,并且红外显示PSP1具有典型的多糖特征吸收峰,同时含有吡喃糖结构。黏度法测定多糖PSP1的平均相对分子质量约为1.12×105 Da。按照乙醇浓度90%、料液比1:1、干燥温度60℃的条件制得的胶囊剂符合《中国药典》要求。