论文部分内容阅读
桃是世界上重要的经济果树和园林树种,同时也是蔷薇科木本模式植物,研究桃的种质资源和遗传背景具有重大意义。在当前,SSR标记仍然是研究植物物种种质资源和遗传背景的重要手段之一。然而,桃的可用SSR引物数量稀少,蔷薇科其他物种的SSR引物数量更是寥寥无几。2013年,Verde等人基于桃的不同器官进行了转录组测序,汇总先前的研究后共提交到NCBI公共数据库有80797条无冗余ESTs序列,为桃EST-SSR引物的大规模开发提供了丰富的序列资源。本研究先利用MISA软件对来自NCBI数据库的80797条EST序列进行SSR位点挖掘,然后利用primer3模块批量设计SSR引物,最后,采用PCR技术在12个不同类型的桃品种上分组随机验证了100对二核苷酸重复引物,在30个常见蔷薇科物种上分组随机调查了48对桃EST-SSR引物的通用性。主要研究结论如下：(1) EST-SSR位点挖掘利用CD hit软件对80797条无冗余EST序列的冗余率进行复查,发现冗余率仍有12.3%。用MISA软件对剩余70360条EST序列进行SSR位点挖掘,发现有12519个SSR位点分布于10272条ESTs序列中,SSR位点出现频率为14.60%。SSR类型覆盖二核苷酸重复到六核苷酸重复的159种基序类型。其中,以单核苷酸重复、二核苷酸重复和三核苷酸重复类型最多,分别占35.80%、36.43%和25.56%。此外,SSR基序重复次数越多,SSR位点分布频率越低。在基序长度相同的SSRs中,不同基序组成分布不均匀,并且对少数基序组成有偏好。(2)SSR引物设计利用primer 3模块对12519条EST-SSR设计引物,得到4526对SSR引物,其中,常用的二核苷酸引物和三核苷酸引物合计有2598对。引物开发效率只取决于EST-SS R基数的大小,引物开发总效率为36.15%。(3) SSR-PCR验证分段抽选的100对SSR引物在12个不同类型的桃品种上扩增出237个条带,平均2.37个；79%的引物能够扩增出2个或2个以上的条带。期望杂合度变幅为0-0.7659,平均0.3817；观察杂合度变幅为0-0.9167,平均0.1230；引物鉴别力变幅为0-0.8056,平均0.4054。(4)通用性研究通用性分析表明：66.67%的SSR引物能够在30个蔷薇科物种上全部有效扩增,33.33%的SSR引物能够在30个蔷薇科物种中部分有效扩增。其中,引物018在16个物种上有缺失,是缺失率最高的引物；物种R30有7对引物没有扩增,是缺失程度最高的物种。95%以上的引物可以在66.67%以上的物种上得到有效扩增,90%以上的引物可以在93.33%的物种上得到有效扩增。