研究背景急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由多种直接致病因素(如肺挫伤、吸入性损伤、肺炎、误吸、机械通气)和间接致病因素(如感染、输血、胰腺炎、创伤性脑损伤)引起的常见危重病征。基础研究证实,ARDS的本质是炎症反应导致肺上皮细胞和血管内皮细胞的损伤,其中炎性细胞因子和趋化因子构成的复杂“网络”在调节、放大、维持肺部炎症过程扮演了重要角色。ARDS早期,肺巨噬细胞可被巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)等炎性细胞因子活化,分泌其它多种炎症因子(IL-1,IL-6,IL-8,IL-10,TNF-α),同时促进趋化因子的释放,进而募集、活化中性粒细胞。活化的中性粒细胞又可以进一步释放氧化物、蛋白酶、白三烯及其他炎症介质损伤肺组织。这提示,MIF可能是肺部炎性因子级联反应中处在较为上游的促炎因子。临床研究发现MIF在ARDS异常升高,提示MIF是潜在的ARDS发生和预后的重要生物标志物,但其实际应用价值并未确立。2003年,Leng等发现CD74是MIF的高亲和力受体。Takahashi等进一步发现MIF与CD74结合后激活下游信号通路,诱导炎症因子的释放,参与ARDS肺炎性损伤,抗CD74抗体可阻断上述通路,抑制炎症因子的表达,起到治疗作用。2014年2月,Assis等率先在自身免疫性肝病患者的血清中检测到CD74的可溶型形式,即可溶型CD74(Soluble CD74,sCD74),且其浓度显著高于正常人群。此外,自身免疫性肝病患者外周sCD74主要是由肝星状细胞分泌的,可竞争结合循环中升高的MIF并形成MIF-sCD74复合物,通过减少MIF与成纤维细胞膜上CD74的结合干扰MIF介导的细胞内信号转导,进而中和MIF的生物活性。根据既往研究基础,MIF通过与膜表面CD74结合,启动下游信号通路,诱导效应蛋白表达,参与ARDS肺炎症的发生。另一方面,sCD74来源于膜表面CD74,并且能在患者血清中被检测到,但sCD74在肺部疾病领域至今尚无文献报道。因此,我们猜想sCD74与烧创伤所致ARDS具有何种关系呢?为了阐明上述问题,我们开展了两部分研究内容。第一部分是采用经典炎性肺损伤小鼠模型,比较肺损伤小鼠与正常小鼠肺组织CD74的表达量及外周sCD74的水平,并与肺损伤严重程度和炎症程度进行相关性分析,以了解sCD74与ARDS可能存在的关系。随后,通过细胞实验探索sCD74的细胞来源和生物学功能。第二部分是通过回顾性病例对照研究分析ARDS患者临床数据和生物学指标,验证动物实验结果,评估血清sCD74预测ARDS患者临床结局的价值。第一部分炎性肺损伤小鼠外周scd74的表达水平及其生物学作用初探(基础实验)研究目的:(1)观察scd74在炎性肺损伤小鼠外周血及肺泡腔内表达水平,探讨scd74与肺损伤严重程度的关系;(2)探索scd74的细胞来源和生物学作用。研究方法:建立脂多糖(lipopolysaccharide,lps)气道滴入和盲肠结扎穿刺(cecalligationpuncture,clp)所致炎性肺损伤小鼠模型,在指定时间点取血清、肺组织、肺泡灌洗液等标本;采用rt-pcr法检测肺组织cd74的mrna含量,westernblot法检测肺组织cd74蛋白表达量,免疫组化和免疫荧光法对肺组织cd74进行定位;采用斑点印迹法及elisa法检测血清和肺泡灌洗液scd74含量,分析scd74及炎症因子水平的相关性;采用he染色、肺泡灌洗液蛋白浓度、肺组织湿/干重比反应肺损伤程度,分析scd74与肺损伤程度的关系;采用rmmif刺激巨噬细胞raw264.7和肺上皮细胞mle-12,检测细胞cd74表达量及上清scd74含量,并检测细胞活性和凋亡情况;采用rmscd74-fc与rmmif同时或单独刺激巨噬细胞raw264.7,检测上清炎症因子水平。研究结果:lps气道滴入和clp所致炎性肺损伤小鼠与对照组相比,肺组织cd74在基因和蛋白层面均表达增高;免疫组化和免疫荧光染色显示cd74主要位于肺巨噬细胞膜表面;炎性肺损伤小鼠血清和肺泡灌洗液scd74含量明显高于对照组,并且与肺组织损伤程度相关;此外,肺泡灌洗液scd74浓度与mif、tnf-α、il-6成正相关;rmmif刺激巨噬细胞raw264.7可于上清检测到scd74,而rmmif刺激肺上皮细胞mle-12无scd74释放;当低浓度rmscd74-fc(10-~200ng/ml)与rmmif同时刺激巨噬细胞raw264.7时,rmmif引起的tnf-α和mip-2的释放被抑制;scd74单独刺激raw264.7亦可引起炎症因子释放。研究结论:(1)炎性肺损伤会引起肺组织cd74表达增高,及血清和肺泡腔内scd74水平增高,且scd74水平与炎性肺损伤严重程度和肺炎症程度成正相关关系;(2)巨噬细胞是scd74的细胞来源之一,scd74不仅可中和mif的促炎作用,亦可刺激炎症的发生。第二部分scd74在烧创伤所致ards中的临床意义(临床试验)研究目的:探讨ards患者血清scd74水平的变化及其对ards患者临床结局的预测价值。研究方法:采用回顾性研究(clinicaltrial注册号:nct02201446),以elisa法检测81例符合ards柏林诊断标准的患者血清scd74的含量,比较第1日和第3日水平,并与58例健康志愿者作比较;根据ARDS患者结局分为存活组与死亡组,比较两组一般数据及血清sCD74等指标的差异;采用ROC曲线评估各检测指标预测ARDS患者预后的价值;采用线性回归和Logistic分析法分析sCD74对ARDS患者预后的影响。研究结果:ARDS患者平均年龄48.02±16.05岁,其中男性患者44例(占比54.3%),创伤所致ARDS为35例(占比43.2%),吸入性损伤所致ARDS为46例(占比56.8%),入院当日APACHE II评分为14.35±6.39,接收机械通气患者51例(63.0%),28天脱机时间中位数为22天,氧合指数为2.1±0.46,ICU住院时间中位数为23天,死亡患者14例(17.3%);死亡患者与存活患者在原发致伤因素、APACHE II评分、机械通气、28天脱机时间、氧合指数经比较,差异具有统计学意义(p<0.01)。ARDS患者第1日血清MIF、TNF-α、IL-6、sCD74浓度分别为73.64±23.27ng/ml,97.09(92.32,100.82)pg/ml,101.63(79.5,138.9)pg/ml,75.83(65.76,96.36)ng/ml,第3日血清MIF、TNF-α、IL-6、s CD74浓度分别为129.27±41.12ng/ml,138.67±64.26pg/ml,305.36±177.14pg/ml,117.0(105.2,160.1)ng/ml,均显著增高。死亡患者第1日血清sCD74浓度77.96(65.82,124.63)ng/ml高于存活患者75.25(64.99,95.74)ng/ml,但差异无统计学意义(p>0.05);然而,死亡患者第3日血清sCD74浓度[(160.9(133.7,179.3)]与存活患者[115(103.9,147.0)]相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。患者第3日血清sCD74与MIF、TNF-α、IL-6均成正相关关系(相关系数分别为:r=0.333,p<0.01;r=0.409,p<0.01;r=0.303,p<0.05)。第1日、第3日血清MIF预测患者死亡的ROC曲线下面积分别为0.58,95%CI:(0.38-0.78)和0.52,95%CI:(0.38-0.72),第1日、第3日血清sCD74预测患者死亡的ROC曲线下面积分别为0.47,95%CI:(0.29-0.64)和0.75,95%CI:(0.61-0.89)。生存分析结果显示第3日血清sCD74<151 ng/ml组患者生存率高于sCD74>151 ng/ml组,差异有统计学意义(p<0.05);第1日血清sCD74<118 ng/ml组患者生存率高于sCD74>118 ng/ml组,但差异无统计学意义(p<0.05)。线性回归分析显示第3日血清sCD74每增加1ng/ml,呼吸机使用天数增加0.11天,多元Logistic回归分析显示sCD74是ARDS患者死亡的独立危险因素(第1日血清sCD74:OR=13.21,95%CI:0.83-209.79,p=0.067;第3日血清sCD74:OR=6.72,95%CI,1.435–31.4,p=0.016)。研究结论:ADRS患者早期血清sCD74水平显著升高,与ARDS病程、严重程度及不良预后密切相关。