1目的将中药化合物的SMILES结构引入寒热药性研究,并通过MACCSkeys密钥将寒热属性中药化合物转化为分子子结构,然后采用随机森林算法基于分子子结构构建中药寒热属性判别模型,再结合体外实验进一步探索中药寒热药性的物质基础,以期为中药寒热药性研究提供研究思路和参考依据。2方法2.1算法研究2.1.1寒热属性中药数据收集及建模首先,通过2020版《中国药典》筛选出寒性和热性中药的相关化合物,其筛选原则包括:药典中明确规定中药的属性是“寒性”或“热性”,若出现“凉性”或“温性”则不考虑纳入;（1）临床上经常采用的植物类中药;（2）对《中国药典》中纳入的药性不太明确的中药,从中药属性、是否为植物类中药两方面考虑,由中医从业人员投票进行筛选。其次,完成筛选后,通过TCMSP、TCMID检索寒性中药和热性中药的化合物,建立寒性药物和热性药物化合物关键数据集,然后将两个数据集中重复化合物删除,再通过TCMSP和PubChem数据库检索寒性药物和热性药物关键化合物的SMILES结构。最后,采用MACCSkeys密钥将两个数据集中的化合物SMILES结构转化为计算机可识别的二进制语言,分算为167x266维的矢量数据,通过随机森林算法对每味中药的化合物结构数据进行分类,进而建立中药寒热药性判别模型。2.1.2寒热属性中药判别模型的验证为避免人工选择典型寒热属性中药带来的差异,本课题采用文本挖掘技术对SinoMed,CNKI,PubMed数据库中发表的与寒性药物和热性药物相关的文献进行采集,记载文献中提及的中药药性和该味药物发表的文献研究数量。再根据两本国内外均出版的中药古籍《神农本草经》和《本草纲目》核对中药药性,最终筛选出用于验证的典型的寒热属性中药。通过TCMID、TCMSP和PubChem数据库检索典型中药的化合物及其SMILES结构用于验证寒热属性中药判别模型。2.1.3寒热属性中药靶蛋白功能分析经过TCMSP以及其他中药化合物数据库,收集典型寒热属性中药的化合物,去除重复后,查询化合物对应的关键靶蛋白。采用Cytoscape 3.7.2软件构建寒性药物和热性药物的靶蛋白群组,去除重复蛋白后,根据寒性药物的靶蛋白数纳入数量相近的热性药物靶蛋白,导入IPA软件中分析寒性药物和热性药物各自作用的生物关键通路和疾病,以此探索寒性和热性中药在生物关键通路、治疗疾病上的差异。2.2实验研究2.2.1寒热属性中药单体对细胞增殖率的影响对A549细胞加入典型寒性和热性中药的化合物,分别设定不同梯度的药物浓度来培养细胞24小时,并观测细胞的存活率和增殖率。然后选取药物作用的最佳剂量,观察最佳剂量下寒性药物和热性药物作用24小时后细胞的生长和增殖变化,从而从细胞层面研究寒性药物和热性药物的作用差异,最后采用GraphPad Prism 8软件进行数据分析和处理。2.2.2寒热属性中药单体对细胞中能量代谢关键基因表达的影响采用实时荧光定量PCR技术研究寒性和热性药物对能量代谢关键靶点的基因相对表达量,并使用GraphPad Prism 8软件分析实验所得数据。3结果3.1算法研究结果3.1.1中药寒热属性药物数据收集及建模结果通过2020版《中国药典》筛选出148味寒性中药和118味热性中药,然后通过TCMSP和PubChem数据库检索到5196个热性中药化合物和5366个寒性中药化合物,其中有多个活性成分由多味中药所含有。去除重复后,共纳入5323个中药化合物用于构建中药寒热药性判别模型,最终模型的AUC值为93.3%,模型准确率为93.3%,并且发现CH2=A、ACH2AACH2A和CH3＞2分子子结构在寒性药物中占比均小于20%;OCO、CH3AACH2A和CH3ACH2A在寒性药物的分子子结构中占比高达42%,是寒性药物的关键分子子结构。CH3AACH2A、ACH2AACH2A、CH3AACH2A和CH3＞2分子子结构在热性药物中占比高达48%,是热性药物的关键分子子结构。3.1.2中药寒热属性药物判别模型的验证文本挖掘共筛选出10味典型寒热属性中药,其中寒性药物3味,热性药物7味。检索10味寒性和热性中药化合物并导入中药寒热属性模型中进行验证,10味中药中有9味中药的属性判断均准确,判断的准确率为90%,与构建模型的准确率93.3%相近,表明该模型能有效判断中药的寒热属性。3.1.3寒热属性中药靶蛋白功能分析结果典型寒性中药成分共检索到417个靶蛋白,典型热性中药成分共检索到1081个,构建了寒性和热性药物靶蛋白群组。去除重复后,得到寒性和热性药物各自特有靶蛋白,对热性药物靶点进行均衡筛选,以保持寒性和热性药物纳入数量相近的靶蛋白,其中寒性药物靶蛋白265个和热性药物靶蛋白296个。IPA分析发现TP53在寒性药物作用网络中处于中间位置,表明该分子与其他寒药靶蛋白联系密切;热性药物中TP53,ESR1,CONA2,MFKBIA,MDM2,GSTR1,CDK2,MMP9,EGPR,AR,GAPDHPPARG,ESR2,BIRC5,CREK1 蛋白与热性药物蛋白群中其他蛋白相互作用更为紧密。经典生物通路分析发现寒性药物作用于褪黑素降解经典通路、安非他酮降解、雌性激素生物合成、丙酮降解Ⅰ（制乙二醛）、尼古丁降解通路Ⅲ、褪黑素降解通路Ⅰ、尼古丁降解Ⅱ、白三烯生物合成、褪黑激素Ⅱ、瓜氨酸-硝酸氧化周期通路;热性药物作用于锥体素降解的经典路径、安非他酮降解、雌性激素生物合成、丙酮降解Ⅰ（针对甲基乙二醛）、褪黑素降解通路Ⅰ、脂肪酸β氧化Ⅰ、缬氨酸降解Ⅰ、超氧自由基降解通路以及尼古丁降解主要通路Ⅰ和Ⅲ。疾病相关生物分析发现典型寒性药物侧重于治疗肥胖、淀粉样变性、进行性神经紊乱等疾病;典型热性药物侧重于治疗阿尔茨海默病、心血管系统形态学、淋巴系统肿瘤、白细胞肿瘤等疾病。毒理功能分析发现,寒性药物毒理作用的疾病或信号通路为心肌肥厚、芳基烃受体信号、肾结石或细胞死亡等;热性药物毒理作用的疾病或信号通路为肾结石或细胞死亡、肝坏死或细胞死亡等。3.2实验研究结果3.2.1寒热属性中药单体对细胞增殖率的影响结果CCK-8实验结果表明,A549细胞在加入寒性药物黄连单体黄连素和生地黄单体豆甾醇后细胞存活率降低,5个药物浓度下细胞的存活率均低于80%,细胞的增殖率均在100%以下,同时,随着药物浓度的增加,细胞的存活率、增殖率呈现明显的下降趋势。热性药物附子单体乌头碱和吴茱萸单体芝麻素使用后细胞的存活率升高,5个药物浓度下细胞的存活率均大于100%,细胞的增殖率均在110%以上,同时随着药物浓度的增加,乌头碱作用下的细胞增殖速率下降,芝麻素作用下细胞的增殖率仍处于上升趋势。3.2.2寒热属性中药单体对细胞中能量代谢关键基因表达的影响结果实时荧光定量PCR技术检测结果表明,与空白对照组相比,寒性和热性药物单体使MAOA基因表达量呈现下降趋势;与热性药物单体对比,寒性药物单体豆甾醇对MAOA基因的相对表达量有明显的促进作用（P＜0.05）,表明MAOA可能是典型寒性药物的特异性靶点。与寒性中药对HADHB和EHHADH基因的影响相比,热性药物单体乌头碱和芝麻素单体对HADHB和EHHADH基因的表达呈现促进作用（P＜0.05）,其中附子单体乌头碱作用后HADHB的表达量超过空白对照组（P＜0.05）,芝麻素单体作用后EHHADH的表达量超过空白对照组（P＜0.05）,同时与典型寒性药物相比,HADHB和EHHAD在热性药物作用下表达量均高于寒性药物（P＜0.05）,这表明HADHB和EHHADH可能是热性药物的特有靶点。与能量代谢相关的基因cox-5a、UCP-1、AMPK在加入热性药物后,其整体表达量上调（P＜0.05）,同时寒性药物黄连单体黄连素、生地黄单体豆甾醇对cox-5a、UCP-1、AMPK的基因表达量整体下调（P＜0.05）。4结论中药寒热属性药物可以通过化合物SMILES结构表征中药寒性和热性的差异,并且基于化合物SMILES结构构建的中药寒热属性判别模型对于药物的寒热属性有较高的准确度和可靠性。典型寒性和热性中药的关键靶蛋白在生物通路和作用疾病以及毒理作用上存在差异。实验研究表明典型寒性中药能抑制细胞的生长率和增殖率,热性药物能促进细胞的生长率和增殖率;同时寒性药物能抑制能量代谢相关基因的表达,热性药物能促进能量代谢相关基因的表达。