论文部分内容阅读
目的：构建两条能表达针对hTERT的siRNA的重组质粒hTERT-S370和hTERT-S371。方法：搜索Genbank中的hTERT基因序列,筛选出最优的干扰靶位点,并在GenBank中进行BLAST分析,选取序列；根据靶位点和pSilence4.1-CMV neo表达载体的特点,设计、合成表达模板；将表达模板连接到载体上,构建hTERT-siRNA表达载体；重组质粒进行酶切、测序鉴定。结果：合成的S370和S371两对寡核苷酸单链退火形成双链,2%琼脂糖凝胶进行电泳,结果显示两片段均为55bp,琼脂糖凝胶电泳图显示清晰条带。重组质粒经HindⅢ及BamHI双酶切后,琼脂糖凝胶电泳示：重组质粒在电泳图上于预期位置出现阳性条带与实验预想一致,初步鉴定正确。测序结果表明siRNA表达模板成功构建于pSilence4.1-CMV neo载体上,序列完全正确。结论：以hTERT基因为靶点的siRNA序列设计合理,成功获得两条均为55bp的hTERT-S370和hTERT-S371。经酶切和测序鉴定证实hTERT-S370和hTERT-S371表达模板分别成功构建于pSilence4.1CMV neo载体上,获得两条重组质粒plasmids Silencer 4.1-CMV neo-hTERT-S370和Silencer 4.1-CMV neo-hTERT-S371,序列完全正确。目的：用重组质粒pSilencer4.1CMV neo- hTERT-siRNA转染PANC-1胰腺癌细胞,初步观察其在体外细胞水平上的抗胰腺癌作用。方法：通过脂质体2000将pSilencer4.1-CMVneo-hTERT-siRNA转染PANC-1细胞,并通过G418进行阳性细胞筛选；筛选2周后,通过稀释法挑细胞克隆；对单克隆化的细胞进行hTERT基因表达的RT-PCR检测；结果：RT-PCR结果显示：S370-A1组、S371组、S370/371-D4组、S370/371-B5组、S371AC组、S371AC-E5组、S371AC-A2组、S371AC-C1组、S371AC-C2组PANC-1细胞中hTERT-mRNA的表达较NC阴性对照组和细胞组PANC-1细胞中hTERT-mRNA表达量显著下降。同时内参照GAPDH,各组间无明显差别结论：重组质粒pSilencer4.1 CMVneo-hTERT-siRNA能特异性的诱导同源互补的mRNA降解,下调hTERT mRNA表达,具有良好的RNAi沉默效应。