目的:1.纯合型家族性高胆固醇血症（Homozygous Familial Hypercholesterolemia,HoFH）是一种严重的由基因突变导致的脂蛋白代谢障碍类疾病,可导致儿童或青年期早发冠心病并危及生命。就目前对杂合高胆固醇血症（Familial Hypercholesterolemia,FH）的研究看来,中国FH患者的遗传背景与其它国家及种族人群差异明显,但目前尚未有大样本的针对中国HoFH患者的系统研究。本研究旨在针对中国唯一的大样本HoFH队列进行临床特征及遗传背景等信息的研究,探索我国HoFH常见致病突变的种类、频率、地域分布规律,为建立我国的FH基因筛查方法提供实验室基础。2.目前针对FH的基因检测多用于疑似FH患者的确诊,很少用于辅助临床鉴别诊断特殊病例或探索基因型与临床表型之间的关联。本研究第二部分通过2例临床诊断为FoFH基因型检测为FeFH的特殊病例,探索基因检测用于辅助鉴别诊断特殊病例,并探索通过基因突变解读临床表型的应用。3.FH患者的早期诊断对于该人群生存期的延长以及生存质量的提高等方面都至关重要,而我国实际得到早期诊断并得到适当治疗的人数极少,除了部分致病突变尚不明确外,另一重要原因就是现有检测方法费用昂贵。目前广泛采用的FH筛查策略中,通过胆固醇水平来检测初步筛选可疑的FH患者,再通过目标区域捕获富集或扩增子进行下一代的方法性价比较高,但作为FH这种发病率较低的疾病的筛查手段来说,成本仍然过高,难以大范围开展。本研究在此次情况下,建立和优化了基于下一代测序的二阶段式多基因区FH突变基因检测方法,探索适合我国国情的FH基因筛查方法,以促进提高FH的诊断率。本研究对于有效筛查和早期诊断FH,解决我国FH基因筛查的瓶颈问题具有重要意义。研究方法:1.本研究从全国招募来自45个HoFH家系和7个HeFH家系的48例HoFH患者、14例HeFH患者和1例健康的HoFH亲属。所有登记的个人都被要求提供完整的病历,包括以前在其他医院就诊的病历。常规采集患者外周血分离血清标本,使用日立7600-020自动分析仪（日本日立）按照医院检验科日常检测流程对其血脂水平进行检测。全血标本提取基因组DNA后使用SureSelectXT Custom 0.5-2.9Mb Kit建库试剂盒创建文库,并使用Hiseq 4000测序仪（illumina,美国）根据双端150bp测序的官方标准操作流程进行测序。使用ANNOVAR进行注释,通过DbSNP、1000Genome、ExAC、CADD和HGMD等多种数据库获得变异位置、变异类型、保守性预测等信息。再通过基因转录注释数据库（如Concesus CDS、RefSeq、Ensembl和UCSC）来获得氨基酸的改变信息。所有变异位点都使用SIFT、Polyphen2_HDIV、Polyphen2_HVAR、MutationTaster、FATHMM、CADD、LRT以及gerp++gt2等生信预测算法进行功能及致病性预测。所有可疑致病位点根据AMCG指南（2015）标准进行致病性分级。2.针对临床诊断为HoFH基因型诊断为HeFH的两名患者,收集并分析家族史,个人疾病史和生活习惯等信息,结合实验室自主设计的FH基因筛查方法对患者及其亲属的DNA样本下一代测序筛查和Sanger测序验证结果进行FH基因诊断。使用生信算法对检测到的可疑致病变异进行注释和功能预测,并使用SWISS-MODEL对蛋白质结构进行建模,预测检测到的突变对相关蛋白的功能影响,揭示上述基因型为FeFH的患者临床表型的可能原因。3.根据遗传性脂代谢疾病的相关基因信息选取目的基因24个。利用DesignStudio对这24个基因的外显子及UTR区域进行设计和优化,最终形成个性化定制的FH基因筛查Panel。选取安贞医院贞心团队招募入组且应用NGS测序法发现并经Sanger测序验证的携带已知突变位点的FH患者全血冻存样本10例。抽提全血基因组DNA后按照1,2,4,6,8,10例等浓度混样,并使用自主设计的Panel构建文库,应用Miseq测序平台测序,使用Basespace自带程序对产出数据进行注释和分析,分析后得出的结果再次以Sanger测序法验证,最后与NGS+Sanger测序得出的结果进行比对。结果:1.我国HoFH常见致病突变的分布规律本研究来自16个省的63个个体中,HoFH组中包括21名男性和27名女性,基线LDL-C水平为14.11+/-3.39 mmol/L;HeFH组中包括7名男性和7名女性,基线LDL-C水平为6.56+/-1.85 mmol/L。48例临床HoFH基因检测发现,有7例患者基因是纯合突变,占14.58%;其他41例均为复合杂合突变。55个变异位点被确认为class 3或class 4或class5的致病变异。其中,18个变异位点为新发现的变异位点:APOB基因第26号外显子上的c.T10927C（p.S3643P）;LDLR基因第3号外显子上的c.T310G（p.C104G）和c.G292A（p.G98S）,第4号外显子上的c.338₃42del（p.E113fs）和c.649₆60del（p.217₂20del）,第5号外显子上的c.G764T（p.C255F）、c.T727A（p.C243S）和c.720₇21del（p.E240fs）,第7号外显子上的c.T973C（p.C325R）,第8号外显子上的c.T1129G（p.C377G）和c.A1178C（p.K393T）,第10号外显子上的c.C1427T（p.P476L）和c.T1532G（p.L511X）,第11号外显子上的c.1693₁696del（p.G565fs）,第13号外显子上的:c.G1980C（p.Q660H）和c.1899delC（p.R633fs）,第17号外显子上的c.G2487C（p.Q829H）;PCSK9基因第9号外显子上的c.C1426T（p.R476C）,本研究首次报道。检出上述新突变提示我国目前尚有众多潜在HeFH患者未被发现,在HoFH中检测到的突变为更常见的突变类型,可以据此进行FH常见突变筛查。我国FH患者的LDLR致病突变集中于exon4,exon9,exon10区域,突变位点的分布有地域差异,东北地区尤为明显。发现3个高频突变位点:W483X（11.7%）、p.H583Y（7.45%）和p.A627T（5.32%）,高频位点主要集中于我国中部及东部地区,如安徽、河南与湖北。入组的63个个体来自16个省份,其中,有7个LDLR基因上的位点在多个省份出现,包括p.W483X在5个省份有发现;p.H583Y和p.A627T在4个省份有发现;c.C1216A和c.1187-10G>A在3个省份有发现;p.P685L和p.C243S在2个省份有发现。并且发现相同变异位点的省份地理位置分布也相对临近。2.基因检测辅助鉴别诊断HoFH在常规剂量的依折麦布和他汀类药物治疗下,患者的胆固醇水平有效降低至原始水平的33.8%和17.2%。确定了低密度脂蛋白受体（LDLR）中的两个致病突变W483X和新报道突变W483G。两个患者都是各自突变的杂合子。在高胆固醇/碳水化合物饮食影响下,这些突变可能引发严重的FH临床表型,但两位患者对常规医学治疗方案和饮食控制的反应良好。W483X突变导致终止码插入并进一步导致蛋白质结构不完整。尽管根据SWISSMODEL模拟的结构来看,W483G突变不影响蛋白质的完整翻译也没有明显影响蛋白质结构,但它仍然导致了类似W483X的严重FH表型（符合临床HoFH确诊标准）。3.建立二阶式FH突变基因检测方法实验室自主设计的Panel覆盖目标区域的98%,目标全长共计123,509bp。混样样本上机后产出数据Q30碱基百分比为72.19-83.26,扩增子的平均覆盖值为563.4-1668.6,检出SNV数量为212-347个,检出碱基插入数量为41-54个,缺失数量为79-114个。检出的SNV和Indel可以覆盖目标区域,但有部分区域覆盖不良。当人均覆盖深度超过200*时混样检测可以达到100%的已知突变检出率,而低于100乘时结果则不甚可靠,检出率仅达21.43%。介于100到200乘之间的样本位点检出率在70%-90%。与常规目标区域NGS测序进行对比,结果显示本研究采用的方法可以将检测成本降低69.2%,并节约41.2%的检测时间。结论:1.本研究首次获得了来自16个省份的大样本HoFH队列的中国HoFH常见致病突变,并发现了常见致病突变的分布与地理位置相关。2.发现W483G新突变,扩展了东北地区FH的突变谱。揭示了两种突变在某些条件下引起严重的FH表型,提示W483位点有可能对维持LDLR正常功能有重要意义,提供了遗传筛查或药物开发的潜在靶点。3.建立24个FH相关基因外显子区域的靶向区域NGS测序方法,初步显示可辅助FH基因诊断及鉴别诊断FH相关疾病,并辅助指导临床治疗方案的选择,同时可以大幅降低检测成本和时间。4.自建方法在应用于临床之前,实验流程还有待改良和完善,同时还需要加大样本量对该方法的技术参数进行进一步的研究和验证。