第一部分福尔马林致痛大鼠模型NA能神经元变化和AP-2α的表达变化与调控1目的:观察福尔马林诱导疼痛模型大鼠的行为学反应及其脊髓、篮斑(LC)、小脑浦肯野细胞(PC)中DBH和激活蛋白2-α(AP-2α)的表达变化,以探讨在疼痛应激状态下,NA能神经元的内源性镇痛及其调控机制。并探讨AP-2α对DBH和调节机制。方法:①成年Wistar大鼠110只,随机分为对照组和实验组,实验组又分为1、6、24 h和3、7 d五个时间点,采用大鼠足底注射福尔马林的方法,制作福尔马林致痛大鼠模型,对照组则在相应的部位注射等量的生理盐水,分别于相应的时间点取材;②动物足底注射后,立即肉眼观察动物的注射局部体表变化和行为学变化;③应用HE染色、尼氏染色、透射电镜等方法,观察模型鼠脊髓、LC、小脑PC等形态学改变;④应用免疫组化、免疫荧光双标,检测福尔马林诱导致痛模型大鼠脊髓、LC、脊髓DBH和AP-2α的表达变化以及二者共存情况;⑤Western blotting和RT-PCR检测DBH/ AP-2α及其mRNA在脊髓的表达变化;⑥计算机图像分析等方法,测量相关的免疫组化染色强度的变化及阳性神经元数量的变化;⑦利用相关的统计软件对实验结果进行统计分析。结果:①实验动物行为学变化:福尔马林注射后,实验组动物出现了典型的两期伤害表现行为,注射局部出现明显红肿等炎症反应。HE染色显示,模型鼠脊髓、LC、小脑PC无明显的形态学改变;尼氏染色显示,注射福尔马林后模型鼠脊髓、LC、小脑PC表现为神经元内尼氏体染色增强、数量增多,超微结构显示神经元的内质网和高尔基复合体数量增多,稍有扩张。②DBH/ AP-2α在小脑的表达变化:实验组和对照组大鼠小脑PC均对DBH/ AP-2α呈阳性表达。同对照组相比较,实验组PC内DBH/ AP-2α染色强度有显著性增强(P<0.05),在福尔马林注射后3 d时染色最强,注射后7 d时染色强度有所降低,但仍比对照组强。DBH和AP-2α的染色强度具有明显的相关性。免疫荧光双重标记显示DBH和AP-2α在PC中共存。Western blotting结果证实了小脑内DBH/ AP-2α具有和免疫组化相似的变化规律。③DBH/ AP-2α在LC的表达变化:正常组大鼠LC内NA阳性神经元数量较少,染色浅淡;福尔马林疼痛模型大鼠LC内NA能神经元数量明显增加,同时染色强度也明显增强,3 d时增加最为明显,7 d时仍然较高。图像分析和统计学分析显示,模型鼠LC内NA能神经元的数量和染色强度较对照组明显增高(P<0.05);免疫组化结果表明,LC内AP-2α染色强度也明显增强,与正常对照组相比较,具有显著性差异(P<0.05)。④DBH/ AP-2α及其mRNA在脊髓的表达变化:对照组动物脊髓内NA能神经元主要分布于脊髓前角,模型鼠脊髓前角、中间带和后角均出现了大量深染的DBH阳性神经元,3 d时达到高峰,至第7 d时DBH阳性神经元数有所下降,但仍高于正常水平。图像分析和统计学分析表明,疼痛模型动物脊髓内DBH阳性神经元的数量和染色强度明显增加,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05);Western blotting结果证实DBH不同时段的表达变化规律,与上述形态学变化一致;RT-PCR显示了相似的结果。AP-2α的表达变化与DBH的表达变化规律具有显著的相似性(P<0.05)。免疫荧光双标显示DBH和AP-2α共存于脊髓神经元内。结论:本实验结果表明:①证实小脑PC有DBH表达,首次观察到在疼痛应激状态下,PC中DBH表达增强。这一结果提示,小脑PC参与了疼痛应激状态下,运动或者感觉的调节;②福尔马林疼痛模型大鼠LC内NA能阳性神经元的数量明显增多,免疫组化染色强度也在福尔马林注射后明显增多,提示LC的NA能神经元参与了疼痛过程的调控;③在疼痛等应激状态下,脊髓前角NA能神经元内DBH表达明显增强;在脊髓中间带和后角,即非NA能神经元功能区出现大量DBH阳性神经元,推测这些区域内某些神经元的化学性质可能发生了改变,由非NA能神经元转化为NA能神经元,提示神经元具有化学可塑性;④上述区域内AP-2α表达随着DBH表达增强而增加,且免疫双标显示二者共存于同一神经元中,提示AP-2α可能对DBH的活性具有调节作用。第二部分NA和DBH抑制剂对福尔马林致痛大鼠行为学及NA能神经元的影响目的:观察鞘内注射NA和DBH抑制剂(U-14624)后,对福尔马林致痛大鼠行为学和脊髓内NA能神经元DBH表达变化的影响。方法:①健康成年Wistar大鼠66只,随机分为U-14624组、NA组、NS组、PFA+NS组、PFA+U-14624组、PFA+NA组,共6组;②利用大鼠鞘内置管的方法,在大鼠鞘内注射相应的试剂(NS组、PFA+NS组注射NS,NA组、PFA+NA组注射NA,U-14624组、PFA+U-14624组注射U-14624);③大鼠鞘内注射后10 min,再制作福尔马林疼痛模型(PFA+NS组、PFA+U-14624组、PFA+NA组),对照组动物(U-14624组、NA组、NS组)足底注射等量的NS;④福尔马林足底注射后,立即观察动物的行为学变化和体表特征,利用甩尾实验测量动物的基础痛阈和行为学评分方法,并对所获得的数据进行统计学分析;⑤在福尔马林注射后24 h取材,采用HE染色、尼氏染色以及透射电镜等方法,观察各组动物脊髓腰段的神经元形态学变化;⑥利用免疫组化和Western blotting、RT-PCR等方法,对DBH及其mRNA在脊髓的表达变化进行检测;⑦利用计算机图像分析系统对所获得的图像进行分析,并用统计软件对实验数据进行统计学分析。结果:①动物鞘内给药后,各组大鼠均未出现呼吸抑制、死亡以及后肢麻痹等脊髓损伤的表现;②福尔马林足底注射后,大鼠产生典型的两期性伤害表现行为;③单独鞘内注射NA(NA组),对动物的行为学没有显著性的影响(与NS组相比较)(P>0.05),鞘内注射NA后制作的福尔马林疼痛模型(PFA+NA组),其行为学评分显示,对动物的第Ⅰ、Ⅱ期伤害表现行为均能产生明显镇痛的作用(P<0.05),且动物疼痛敏感性降低(P<0.05);④单独鞘内注射U-14624,对动物的行为学没有显著性的影响(与NS组相比较)(P>0.05);鞘内注射U-14624后制作的福尔马林疼痛模型(PFA+U-14624组),与PFA+NS组相比较,其行为学评分显示,对动物的第Ⅰ期伤害表现行为没有显著性改变(P>0.05),但对第Ⅱ期伤害表现行为能产生明显镇痛的作用(P<0.05),但动物疼痛敏感性降低(P<0.05);⑤鞘内注射NA后制作福尔马林致痛大鼠模型(PFA+NA组),24 h取材,免疫组化显示,脊髓内DBH阳性神经元的数量和染色强度比对照组动物(NA组和NS组)明显增多和增强(P<0.05)。与PFA+NS组相比较,阳性神经元的数量和染色强度均降低,且具有显著性差异(P<0.05);⑥鞘内注射U-14624后制作福尔马林致痛大鼠模型(PFA+U-14624组),24 h取材,免疫组化显示,脊髓内DBH阳性神经元的数量和染色强度比对照组动物(U-14624组和NS组)明显增多和增强(P<0.05),但与PFA+NS组相比较,阳性神经元的数量和染色强度有少量的增加,无显著性差异(P>0.05);⑦Western blotting和RT-PCR实验结果也DBH及其mRNA的变化规律与免疫组化相似。结论:大鼠鞘内注射NA,对大鼠具有明显的镇痛作用,且对DBH酶具有明显的负反馈抑制作用。而鞘内注射DBH的抑制剂后,行为学检测发现,对疼痛模型第Ⅰ期伤害表现行为没有显著性影响,但对疼痛模型动物第Ⅱ期伤害表现行为具有显著性的影响,表明U-14624对痛觉的影响不是直接作用,可能是通过抑制DBH活性后,进而影响NA合成量的变化,再导致动物行为学的变化,但该抑制剂对DBH的表达产量没有明显的影响。通过调节DBH的活性,可以影响动物脊髓内NA合成量发生变化,从而对脊髓水平的镇痛进行调节,提示NA参与了脊髓水平痛觉的调制及镇痛过程。第三部分NA和DBH抑制剂对PC和脊髓前角细胞电生理的影响目的:研究NA和DBH抑制剂(1-Phenyl-3 -(2-thiazolyl) -2-thiourea,U-14624)对大鼠小脑PC和脊髓前角神经元静息膜电位及自发动作电位的影响。方法:本实验采用小脑和/或脊髓片可视法膜片钳技术,以大鼠小脑PC和脊髓前角细胞为研究对象,观察NA和DBH抑制剂U-14624对其静息膜电位及自发动作电位的影响。结果:①较之单细胞分离方法,小脑(脊髓)片可视法膜片钳技术容易获得适合膜片钳记录的细胞;②正常脊髓前角神经元的静息膜电位幅度为-43.65±5.21 mV (n=48)。自发动作电位频率为1.62±0.26 Hz;③正常小脑PC的静息膜电位为-50.71±2.21 mV(n=39)。其自发动作电位包括两种形式,即简单锋电位和复杂锋电位,其频率分别为2.86±0.31 Hz和35.37±5.63 Hz;④NA作用后,脊髓前角神经元的静息膜电位幅度为-48.39±7.87 mV(n=24),自发动作电位频率为3.04±0.52 Hz;⑤NA作用后,小脑PC的静息膜电位幅度为-54.29±2.48 mV(n=22),其自发动作电位发生不同的反应,表现为抑制、兴奋和双相反应的细胞分别为68.18%、22.73%和9.09%;⑥DBH抑制剂U-14624作用数min后,脊髓前角神经元的静息膜电位幅度为-38.39±4.19 mV,其自发动作电位频率为0.89±0.20 Hz;⑦DBH抑制剂U-14624作用后,小脑PC的静息膜电位变化不明显,但其自发动作电位频率立即呈现高强度的聚集放电,频率为30.74±13.20 Hz;至作用后5-20 min,则其自发动作电位表现为兴奋、抑制和双相形式,分别占60%、33.33%和6.67%。结论:①小脑和/或脊髓片法得到的小脑和/或脊髓片,能够较好的保存神经元的结构和功能,容易对其电活动进行记录;②NA对脊髓前角神经元静息膜电位和自发放电活动的影响为兴奋作用;NA对小脑PC自发动作电位的影响较为复杂,以抑制作用为主。NA对脊髓前角神经元和小脑PC的作用,可能通过直接与神经元上相关的受体结合,或者通过复杂的神经网络作用,从而影响细胞的电活动;③DBH抑制剂U-14624开始灌流时,对小脑PC自发动作电位的影响主要表现的加强,可能与该物质直接作用于细胞有关;其对脊髓前角神经元自发动作电位的影响主要以抑制为主,而对小脑PC的自发动作电位以兴奋为主。推测U-14624通过抑制DBH活性,影响了NA合成量减少,影响细胞的电活动。本实验对NA及DBH抑制剂U-14624对小脑PC和脊髓前角神经元电活动的影响机制进行了相关的分析。为深入研究这两种细胞的生理作用奠定了基础。