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目的:
膀胱过度活动症(OAB)是临床最常见的膀胱功能障碍,有关OAB发生机理的研究一直是一个热点,近年研究发现β3肾上腺素能受体(β3—AR)是介导逼尿肌舒张的重要因素,而β3肾上腺素能受体基因Trp64Arg单核苷酸多态性(SNP)与其功能密切相关,我们通过比分析OAB病例与正常对照组之间β3—AR的Trp64ArgSNP的基因突变率和基因型,以及存在此突变的β3—AR OAB病例与其他对照组在不同浓度BRL37344(选择性β3—AR激动剂)激活下细胞长度变化的比较,明确此β3—AR基因突变是OAB发生及治疗耐药的一个原因。
方法:
1、研究对象
选取临床年龄均在55—65岁之间,临床诊断为膀胱过度活动症男性病例22名和20名年龄在55—60岁男性正常对照膀胱逼尿肌组织(均已在知情同意的前提下由病人签署知情同意书),内切酶采用限制性内切酶BstNⅠ(酶切位点CC↓(A/T)GC)。BRL37344(SIGMA公司)。
2、对比分析OAB与对照组β3—AR的Trp64ArgSNP基因型及突变率
用DNA提取试剂盒提取DNA,进行PCR。
引物一:CGCCCAATACCGCCAACAC
引物二:CCACCAGGAGTCCCATCACC
酶切反应体系:PCR产物10微升;0.5微升BstN1;2微升10乘Buffer;100乘BSA0.2微升;水7.3微升;条件:60度水浴消化3个小时。4%琼脂糖凝胶电泳,条件为80V,60~90分钟,至溴酚蓝前沿走至胶底部。自动电泳凝胶成像分析仪分析结果。
3、对比分析特异性激动剂作用下β3—AR的Trp64ArgSNP与其引起的细胞长度变化的关系
将经消化的逼尿肌细胞按OAB组存在β3—AR的Trp64ArgSNP、OAB组野生型β3—AR和对照组野生型β3—AR进行分组,各组先予40nmol/LKCI使细胞收缩,再分别加入BRL37344(4个浓度组——10-7、10-6、10-5、10.4mol/L),用倒置显微镜观察细胞长度变化。
结果:
1、OAB与对照组β3—AR的Trp64ArgSNP基因型及突变率
OAB组22名病例发生β3—AR的Trp64ArgSNP病例为12名,突变率55%,其中突变纯合子3名,突变率14%;杂合子名9,突变率41%。对照组20名病例发生β3—AR的Trp64ArgSNP病例4名,突变率20%,皆为杂合子。两组突变率差异有显著性差异(X2=5.30,P<0.05)。
2、β3—AR的Trp64ArgSNP与其引起的特异性β3受体激动剂作用下逼尿肌细胞长度变化的关系
对比分析在BRL37344各个浓度(10-7、10-6、10-5、104 mol)下,OAB组Trp64ArgSNP的β3—AR逼尿肌细胞,野生型β3—AR逼尿肌细胞,以及对照组野生型β3—AR逼尿肌细胞的三种细胞产生的逼尿肌舒张程度,结果表明对照组野生型β3—AR逼尿肌细胞舒张程度最高,OAB组Trp64ArgSNP的β3—AR膀胱逼尿肌细胞舒张程度最低,三者相比其差异有显著性意义。(P<0.001)
结论:
1、OAB组病例β3—AR的Trp64ArgSNP突变率明显增高,β3—AR的Trp64ArgSNP与OAB的发生有关。
2、OAB病例组Trp64ArgSNP的β3—AR逼尿肌细胞的BRL37344浓度依赖性细胞松弛作用明显低于该组中野生型的β3—AR逼尿肌细胞,β3—AR的Trp64ArgSNP突变是部分OAB病人对肾上腺素能受体激动剂治疗效果不佳的一个原因。