论文部分内容阅读
黏膜免疫系统是人和动物机体整个免疫网络的重要组成部分,又是具有独特结构和功能的独立免疫系统,在抵抗感染方面起着积极重要的作用。首先,黏膜表面与外界抗原(主要指病原微生物)接触,是机体抵抗感染的第一道防线；其次,黏膜免疫系统具有共同黏膜免疫共享机制,这一机制能将全身黏膜免疫状态达成一致；再次,黏膜免疫可同时诱发黏膜免疫和系统免疫应答。因此,黏膜免疫日益受到重视,改变免疫策略,设计黏膜免疫疫苗,对预防传染病的发生具有重要意义,也是传染病预防领域的新技术热点之一猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)一直是危害世界养猪业比较严重的疾病,给世界养猪业造成巨大的经济损失。由于其病毒的致病特点,使目前的商品化疫苗存在着缺陷,不能完全阻止经呼吸系统及胎盘传播猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)。鉴于此,本研究结合PRRSV的致病特点、免疫特性及生物学特性探索性的设计黏膜免疫新型疫苗,对预防该病具有重要意义。试验选取PRRSV的ORF6基因作为目的基因,乳酸乳球菌乳链菌肽控制表达(nisin controlled expression, NICE)系统为抗原递呈载体,构建重组乳酸乳球菌活载体疫苗,并对其免疫反应原性及佐剂效力进行评价。主要研究工作和结果如下：1、试验将PRRSV经Marc-145细胞培养后,进行RT-PCR扩增,获得大小为515bp的抗原基因ORF6,将其克隆到PMD19-T载体后测序,核苷酸序列未发生变异。根据测序结果和乳酸乳球菌表面表达载体PNZ8149特点,设计引物,扩增并纯化出两端含有Sac Ⅰ和NcoⅠ酶切位点的PRRSV的ORF6基因片段,将纯化后的ORF6基因与表达载体pNZ8149进行连接,连接产物采用电转化方法将其转入食品级乳酸乳球菌NZ3900细胞中构建重组菌,命名为PNZ8149/NZ3900-M/PRRS。进一步对PNZ8149/NZ3900-M/PRRS进行诱导,诱导剂乳链杆菌肽(Nisin)添加量为10ng/mL诱导时间分别为2h、4h、6h、8h、10h和12h, SDS-PAGE分析,在19KD处出现了预期的条带,表达了分子量为19KD的蛋白,诱导6h条带比较清晰,是最佳的诱导时间。间接免疫荧光实验表明,重组菌表达蛋白定位于菌体细胞表面且具有反应原性。试验结果表明,成功构建了以乳糖为选择标记的食品级重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS,为开发PRRSV的乳酸乳球菌黏膜免疫疫苗奠定了理论基础。2、将构建的重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS免疫BALB/c小鼠,将小鼠随机分成4组(n=30),组Ⅰ鼻腔免疫PBS缓冲溶液,为空白对照组；组Ⅱ鼻腔免疫空载体菌株培养液,为载体对照组；组Ⅲ鼻腔免疫重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS悬浮菌液,为鼻腔免疫实验组；组Ⅳ口服免疫重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS悬浮菌液,为口服免疫实验组。各组试验动物被连续免疫(即：1d,2d,3d,11d、,12d,13d,21d,22d,23d),免疫剂量为50ul,悬浮菌液细菌含量为1×1011CFU/mL。试验动物在最后一次免疫后0d、7d、14d、21d、28d分别被处死,每次每组处死6只,取血液、肠粘液、呼吸道冲洗液检测抗体,采用间接ELISA方法检测血清中特异性IgG和黏膜中s-IgA抗体含量,评价其动态变化情况,并在最后一次免疫后14d取脾脏进行细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10IFN-γ等活性检测。重组乳酸乳球菌经口服免疫和鼻腔免疫后均能刺激黏膜分泌特异性s-IgA,在整个免疫测定期间内,两试验组在呼吸道黏膜及消化道黏膜产生的特异性s-IgA抗体水平均极显著高于PBS对照组和载体对照组((P<0.01),两试验组间滴鼻免疫试验组高于口服试验组,且呼吸道黏膜s-IgA抗体水平差异极显著((P<0.01),消化道黏膜s-IgA抗体水平差异不显著(P>0.05)。在整个测定期间内粘膜抗体s-IgA保持稳定趋势,可能由于抗体测定时间比较迟或测定周期相对较短；同时在最后一次免疫后14天检测小鼠脾细胞悬液IL-5的活性,重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS免疫组明显高于对照组,差异极显著(p<0.01),口服免疫组和滴鼻组无显著差异(p>0.05),IL-5的活性对黏膜免疫的调节起重要作用,协同其它细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-6等)刺激B细胞的增殖与分化,促进活化的B细胞分化成IgA+B细胞,合成分泌型IgA。重组菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS免疫小鼠后,两试验组脾细胞悬液中IL-2和IFN-γ与对照组差异极显著(p<0.01),滴鼻免疫组IL-2和IFN-γ水平高于口服免疫组,滴鼻免疫实验组IL-2和IFN-γ水平分别达到349.848pg/ml和173.276pg/ml,口服免疫实验组IL-2和IFN-γ水平分别达到335.455pg/ml和162.913pg/ml；IL-4水平在各组之间差异不显著(p>0.05),但滴鼻免疫实验组略高于口服实验组,分别为21.466pg/ml和19.799pg/ml。重组菌试验组血清中特异性IgG抗体水显著高于PBS对照组和载体对照组,差异极显著((P<0.01)；鼻腔免疫组抗体水平在最后一次免疫后7天达到最高,在整个测定时间内维持在高水平,口服免疫组抗体水平在最后一次免疫后21天达到最高水平,然后迅速下降。以上结果表明,重组菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS经口服及鼻腔免疫后,能诱导产生粘膜免疫反应,并同时激发Thl型系统免疫应答,即体液免疫和细胞免疫应答,并且滴鼻免疫途径优于口服免疫途径。3、将构建的重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS抗原与黏膜佐剂CpG ODN联合鼻内免疫BALB/c小鼠,评价其佐剂效应。试验选取BALB/c小鼠90只,随机分为3组(n=30),分别为重组菌对照组(组Ⅰ)、佐剂+重组菌实验组(组Ⅱ)和佐剂对照组(组Ⅲ),佐剂免疫剂量每只小鼠为10ug,重组菌免疫剂量、免疫方法及检测指标同第二部分试验。结果得出CpG ODN佐剂协同重组菌抗原组血清特异性抗体IgG高于单独佐剂组和抗原组,呼吸道和肠道黏膜s-IgA水平高于单独佐剂组和抗原组,并且呼吸道黏膜s-IgA抗体水平高于肠道黏膜抗体；最后一次免疫后14天检测脾细胞悬液中IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-5的活性。IL-2、IFN-γ和IL-5的活性佐剂CpG ODN协同重组菌抗原组高于单独抗原组(p>0.05),显著高于单独佐剂组(P<0.01)；IL-4水平在各组之间差异不显著(p>0.05)。结果表明CpG ODN能协同重组菌提高小鼠黏膜免疫和系统免疫反应,为研究安全有效的重组菌黏膜疫苗奠定了基础。