卵巢癌是妇科恶性肿瘤死亡的首位病因。上皮性卵巢癌占所有卵巢癌的90%,恶性程度最高。由于缺乏特异性的症状,卵巢癌起病隐匿,进展迅速,约75%的患者就诊时已出现腹腔内广泛转移及腹水。而大部分患者即便是清除了原发病灶,但最终也会死于复发和转移。本课题组前期利用比较蛋白质组学技术从高、低转移人卵巢癌细胞株,HO-8910PM和HO-8910中筛选并鉴定了17个差异表达蛋白,程序性细胞死亡6蛋白(PDCD6)就是其中差异蛋白之一。PDCD6是钙结合蛋白,最初的研究发现它参与T细胞受体,FAS-糖皮质激素诱导的程序性细胞死亡。然而,最近的研究报道PDCD6在许多肿瘤组织中表达上调,尤其在转移的肿瘤组织中表达更高。同样,我们前期蛋白质组学结果显示PDCD6在高转移细胞株HO-8910PM中的表达比在母系HO-8910中明显增加。因此,为了进一步探讨PDCD6在卵巢癌细胞中的生物学行为、PDCD6表达与临床卵巢癌的相关性以及其发挥生物学效应可能的分子机制,我们用慢病毒介导PDCD6特异性发夹RNA(shRNA-PDCD6),干扰HO-8910PM卵巢癌细胞中PDCD6的表达,通过实时定量RT-PCR.免疫印迹、CCK8、流式细胞仪、Hoechst染色法和Transwell等技术观察PDCD6对卵巢癌细胞生长、细胞周期、凋亡、药物敏感性以及迁移和侵袭的影响。结果显示慢病毒shRNA-PDCD6感染HO-8910PM72小时后,与阴性对照相比,细胞形态没有明显差异,HO-8910PM细胞生长速度减慢。在迁移实验中,与对照组相比,迁移至膜下层的shRNA-PDCD6-HO-8910PM细胞显著减少(344±26比240±10),p<0.001。侵袭实验中也显示出了相同的结果,与对照组相比,浸润至膜下层的细胞也明显减少(256±8比230±7),p=0.050。PDCD6对细胞周期、凋亡和药物敏感性影响不明显。接着,我们用实时荧光定量RT-PCR技术检测了212例上皮性卵巢癌组织标本中PDCD6mRNA的表达,结合临床病理资料及随访信息,通过秩和检验、卡方检验、Kaplan-Meier曲线和Cox回归等统计方法分析了PDCD6表达与卵巢癌临床病理因素、疗效和预后的相关性。结果表明PDCD6mRNA表达与卵巢癌分期、分级、组织学和疗效均无统计学意义上的相关性,但Ⅲ-Ⅳ期、分级差或浆液性患者PDCD6的表达高于Ⅰ-Ⅱ期、分级好或非浆液性患者。PDCD6mRNA与残余肿瘤大小成正相关(r=0.16,p=0.019)。有残余肿瘤灶的患者PDCD6高表达比例高于没有残余肿瘤灶的患者(29.3%vs.16.7%,p=0.05)。PDCD6mRNA表达与卵巢癌患者总生存无相关性,但与卵巢癌患者无疾病进展生存时间密切相关,PDCD6中表达或高表达患者无疾病进展生存时间明显少于PDCD6低表达患者。Kaplan-Meier法分析显示PDCD6低表达、中表达、高表达患者的5年无疾病进展生存率分别为56%、36%和41%,中位生存时间分别为43、38和21个月(χ2=6.123,p=0.047)。多因素Cox回归分析显示,PDCD6是卵巢癌患者复发独立的预后预测因子。PDCD6中表达或高表达患者复发风险增加,排除了年龄、分期、分级、组织学类型和残余肿瘤大小临床病理因素干扰后,其复发风险分别是低表达患者的1.29倍(95%可信区间：1.08-2.91,p=0.024)和1.57倍(95%可信区间：1.09-2.58,p=0.045)。为了进一步探讨PDCD6在卵巢癌生物行为的分子机制,我们应用Illumina磁珠表达谱芯片,通过生物信息学方法探讨了PDCD6作用的效应基因以及可能的信息传导通路,并筛选芯片结果中表达差异非常显著,而且与肿瘤增殖、转移关系比较明确的基因做实时定量RT-PCR验证。在2次实验中具有重复性变化趋势的差异基因共有133个。其中,有101个基因随着PDCD6表达受干扰而下调,32个基因表达上调。16个基因差异最具有显著性(差异分数小于-30或大于30,P值<0.001),它们是ANGPTL4(血管生成素相关蛋白4)、IER3(早反应基因3)、CCND1(周期素D1)、PDCD6、CNIH(cornichon类似分子)、BMP2(骨形态发生蛋白2)、TGM2(组织转谷氨酰胺酶2C多肽)、SAA1(血清淀粉样蛋白A1)、TRIM31(含三联基元31)、MYC (c-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog)、CD44(吞噬细胞膜糖蛋白)、CXCL16(趋化因子配体16)、C3orf34(chromosome3open reading frame34,染色体3开放阅读框34/CEP19)、CAT(催化酶)、TNFRSF12A(肿瘤坏死因子配体超家族成员12A)、METTL21A(甲基化转移酶样21A)和EN02(烯醇酶2)。除EN02随着PDCD6表达下调而升高外,其它15个基因均随着PDCD6表达下调而下调。其中有2个基因(CCND1、MYC)与细胞周期和增殖密切相关,7个基因(ANGPTL4、TGM2、CD44、CXCL16、SAA1、 TNFRSF12A和BMP2)与血管生成、迁移和侵袭相关。随后,CCND1、MYC、 ANGPTL4、BMP2和CXCL16被RT-PCR实验进一步证实它们在PDCD6干扰实验组中表达下调,是PDCD6可能的效应分子。此外,信号通路富集度分析显示MAPK(丝裂酶原活化蛋白激酶)信号通路中经典的MAP激酶通路(ERK1/2,细胞外信号调节激酶)显著富集,主要激活的基因有：FGFR、MAP2K1/MEK1、 MAP2K2/MEK2、MYC、FOS,结果提示PDCD6与MAPK信号通路关系密切。总之,通过以上关于PDCD6在卵巢癌细胞中生物学行为研究、大样本临床相关性分析以及效应分子探索,我们得出以下结论：1.PDCD6促进上皮性卵巢癌细胞的生长和转移。2.PDCD6过表达与上皮性卵巢癌恶性生物学行为相关。3.PDCD6中表达或高表达患者中位无疾病进展生存时间明显少于PDCD6低表达患者,复发风险增加,是上皮性卵巢癌独立的预后因子。4.PDCD6可能通过MAPK信号通路,上调CCND1、MYC、ANGPTL4、BMP2和CXCL16基因表达,发挥着促进卵巢癌细胞增殖和转移的生物学效应。第一部分干扰PDCD6表达对HO-8910PM细胞增殖、细胞周期、凋亡、药物敏感、迁移和侵袭的影响目的：探讨PDCD6在上皮性卵巢癌细胞中的生物学行为。方法：我们用慢病毒介导PDCD6特异性发夹RNA (shRNA-PDCD6),干扰HO-8910PM卵巢癌细胞中PDCD6的表达,通过实时定量RT-PCR.免疫印迹、CCK8、流式细胞仪、Hoechst染色法和Transwell等技术观察PDCD6对卵巢癌细胞生长、细胞周期、凋亡、药物敏感性以及迁移和侵袭的影响。结果：与阴性对照相比,慢病毒shRNA-PDCD6感染HO-8910PM72小时后,细胞形态没有明显差异,HO-8910PM细胞生长速度减慢。在迁移实验中,与对照组相比,迁移至膜下层的shRNA-PDCD6-HO-8910PM细胞显著减少(344±26比240±10),p<0.001。侵袭实验中也显示出了相同的结果,与对照组相比,浸润至膜下层的细胞也明显减少(256±8比230±7),p=0.050。PDCD6对细胞周期、凋亡和药物敏感性影响不明显。结论：干扰PDCD6的表达导致HO-8910PM细胞增殖减慢,细胞迁移和侵袭的能力明显下降。第二部分PDCD6表达与上皮性卵巢癌临床特征、疗效及预后相关性分析目的：探讨PDCD6表达与卵巢癌临床病理因素、疗效和预后的相关性。方法：我们收集了212例上皮性卵巢癌组织标本和临床病理资料及随访信息,通过实时荧光定量RT-PCR技术检测PDCD6mRNA在卵巢癌组织中的表达。用秩和检验和卡方检验分析PDCD6表达与卵巢癌临床病理因素及疗效的相关性；用Kaplan-Meier生存曲线和Cox回归方法分析PDCD6表达与生存的相关性。结果：PDCD6mRNA表达与卵巢癌分期、分级、组织学和疗效均无统计学意义上的相关性,但Ⅲ-Ⅳ期、分级差或浆液性患者PDCD6的表达高于Ⅰ-Ⅱ期、分级好或非浆液性患者。PDCD6mRNA与残余肿瘤大小成正相关(r=0.16,p=0.019)。有残余肿瘤灶的患者PDCD6高表达比例高于没有残余肿瘤灶的患者(29.3%vs.16.7%,p=0.050)。PDCD6mRNA表达与卵巢癌患者总生存无相关性,但与卵巢癌患者无疾病进展生存时间密切相关,PDCD6中表达或高表达患者无疾病进展生存时间明显少于PDCD6低表达患者。Kaplan-Meier法分析显示PDCD6低表达、中表达、高表达患者的5年无疾病进展生存率分别为56%、36%和41%,中位生存时间分别为43、38和21个月(χ2=6.123,p=0.047)。多因素Cox回归分析显示,PDCD6是卵巢癌患者复发独立的预后预测因子。PDCD6中表达或高表达患者复发风险增加,排除了年龄、分期、分级、组织学类型和残余肿瘤大小临床病理因素干扰后,其复发风险分别是低表达患者的1.29倍(95%可信区间：1.08-2.91,p=0.024)和1.57倍(95%可信区间：1.09-2.58,p=0.045)。结论：PDCD6的过表达与上皮性卵巢癌恶性生物学行为相关；PDCD6中表达或高表达患者中位无疾病进展生存时间明显少于PDCD6低表达患者,复发风险增加,是上皮性卵巢癌独立的预后因子。第三部分基因表达谱芯片筛选PDCD6作用相关基因和信号通路目的：筛选PDCD6作用的效应基因以及相关的信息传导通路,探索PDCD6促进卵巢癌细胞增殖和转移的分子机制。方法：提取病毒感染72小时后的实验组(shRNA-PDCD6-HO-8910PM)和对组照(HO-8910PM-mock)细胞总RNA,扩增生物素标记的cRNA后与Illumina磁珠表达谱芯片进行杂交和扫描。用Illumina bead studio application软件和DAVID数据库进行生物信息学分析,实验重复2次。筛选芯片结果中表达差异非常显著,而且与肿瘤增殖、转移关系比较明确的基因做实时定量RT-PCR验证。结果：在2次实验中具有重复性变化趋势的差异基因共有133个。其中,有101个基因随着PDCD6表达受干扰而下调,32个基因表达上调。16个基因差异最具有显著性(差异分数小于-30或大于30,P值<0.001),它们是ANGPTL4(血管生成素相关蛋白4)、IER3(早反应基因3)、CCND1(周期素D1)、PDCD6、CNIH (cornichon类似分子)、BMP2(骨形态发生蛋白2)、TGM2(组织转谷氨酰胺酶2C多肽)、SAA1(血清淀粉样蛋白A1)、TRIM31(含三联基元31)、MYC (c-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog)、CD44(吞噬细胞膜糖蛋白)、CXCL16(趋化因子配体16)、C3orf34(chromosome3open reading frame34,染色体3开放阅读框34/CEP19)、CAT(催化酶)、TNFRSF12A(肿瘤坏死因子配体超家族成员12A)、METTL21A(甲基化转移酶样21A)和EN02(烯醇酶2)。除EN02随着PDCD6表达下调而升高外,其它15个基因均随着PDCD6表达下调而下调。在这些基因中有2个(CCND1、MYC)与细胞周期和增殖密切相关,7个(ANGPTL4、TGM2、CD44、CXCL16、SAA1、TNFRSF12A和BMP2)与血管生成、迁移和侵袭相关。其中CCND1、MYC、ANGPTL4、BMP2和CXCL16被RT-PCR实验进一步证实它们在PDCD6干扰实验组中表达下调,是PDCD6可能的效应分子。此外,信号通路富集度分析显示MAPK(丝裂酶原活化蛋白激酶)信号通路中经典的MAP激酶通路(ERK1/2,细胞外信号调节激酶)显著富集,主要激活的基因有：FGFR、MAP2K1/MEK1、MAP2K2/MEK2、MYC、FOS,结果提示PDCD6与MAPK信号通路关系密切。结论：PDCD6可能通过MAPK信号通路,上调CCNDl、MYC、ANGPTL4、TGM2、CD44、CXCL16、和BMP2基因表达,发挥着促进卵巢癌细胞增殖和转移的生物学效应。