第一部分 IGFBP-4诱导iPSCs向心肌细胞分化的研究诱导多能干细胞(iPSCs)可以产生患者特异心肌细胞,这为研究心血管疾病发病机制和个体化细胞治疗提供了无限可能。但是iPSCs向心肌细胞分化效率过低是限制其应用的主要因素。Wnt/β-catenin细胞信号通路在心脏发生中具有重要作用。IGFBP-4是最近发现的Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂,因此我们推测,IGFBP-4可作为一个研究iPSCs向心肌细胞分化的有价值分子。本研究中,首先运用统计跳动克隆数目的方法确定了添加IGFBP-4在不同的时间点和不同的浓度条件下对克隆跳动率的影响。通过免疫荧光染色实验,免疫印迹实验和荧光定量PCR实验,我们进一步验证了6-8天添力IGFBP-4可以显著性的提高心肌特异性蛋白和基因的表达。利用激光共聚焦观察免疫荧光染色的结果,我们发现IGFBP-4诱导产生的细胞表达心肌样特异性蛋白。添加IGFBP-4没有促进中胚层标志基因Brachyury的表达,但是促进了心肌早期转录因子的表达。进一步,我们确定了IGFBP-4还会影响中胚层分化来的其他细胞类型标志基因的表达,这说明了过表达IGFBP-4促进向心肌细胞分化并不是特异性的。对全能性基因和与凋亡相关指标的检测表明,IGFBP-4不会提前iPSCs分化时间且没有造成细胞的凋亡。IGFBP-4是Wnt/β-catenin通路的抑制剂,它显著性的降低了P-catenin蛋白的表达量。我们的研究首次把IGFBP-4用于iPSCs向心肌分化的研究,证明了IGFBP-4可以非特异性的提高向心肌分化,并深入的研究了促进分化发生的重要阶段,为研究iPSCs向心肌分化提供了线索并打下了实验基础,这将为心力衰竭的细胞治疗做出贡献。第二部分PML-NBs SP100对Rep蛋白介导的AAV质粒整合系统防御机制研究利用Rep蛋白介导的AAV质粒整合系统来研究AAVS1的定点整合机制并验证其整合能力的研究工作已有很多。该质粒系统由反式提供Rep蛋白的pRC质粒和携带AAV顺式整合原件的质粒所组成。之前的研究都是集中在质粒载体本身,关于细胞对该整合系统的反应并不清楚。SP100蛋白是PML-NBs的重要组成蛋白,它参与了许多细胞反应包括转录调节和针对入侵病毒的细胞内免疫反应。在我们的研究中,利用克隆形成实验发现SP100蛋白可以抑制Rep蛋白介导的AAV质粒整合系统的整合效率。相应的,短暂表达Rep78蛋白可以降解SP100蛋白,并且这种降解在加入蛋白酶体抑制剂MG132的时候可以被回复,提示该降解是通过泛素化途径进行的。通过激光共聚焦发现SP100和Rep78都存在于细胞核当中,这种空间上的共定位提示了二者互相作用的可能性。我们用免疫共沉淀的方法对SP100和Rep78的相互作用可能性进行了进一步验证,Rep78蛋白可以与(EGFP)-SP100融合蛋白共沉淀,却不能与EGFP蛋白共沉淀,确认了SP100和Rep78之间的相互作用。这些研究工作不但丰富了SP100蛋白的功能和细胞对Rep蛋白介导的AAV质粒整合系统反应的认识,而且对我们提高Rep蛋白介导的AAV质粒整合系统的整合效率以及挑选合适的基因治疗靶细胞提供了参考意见。