热激蛋白与超氧化物歧化酶组合元器件提高酿酒酵母耐热性的研究

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酿酒酵母在工业发酵过程中不可避免地受到高温胁迫影响。同时热诱导的氧化胁迫加重了细胞负担。因此为了全面提高酿酒酵母耐热性,应同时解决高温胁迫以及热诱导的氧化胁迫。本文针对上述问题,基于腾冲嗜热菌和嗜热栖热菌的耐热机制,利用合成生物学的方法,在分子层面上设计并构建了热激蛋白与超氧化物歧化酶(SOD)组合元器件,并且成功地应用于高温乙醇合成,主要研究结果如下:(1)对腾冲嗜热菌、嗜热栖热菌以及酿酒酵母进行了主要以热激蛋白和SOD为耐热功能元件和抗氧化功能元件的挖掘,以酿酒酵母中强组成型启动子(FBA1p)为调控元件组装成了16个热激蛋白元器件和2个SOD元器件,并获得工程菌株。(2)利用梯度升温与恒定高温实验筛选出优秀的热激蛋白元器件(FBA1p-shsp-HB8)。通过抗氧化实验筛选出优秀的SOD元器件(FBA1p-sod-MB4)。将二者组装得到工程菌(SOD-MB4-sHSP-HB8)。同时,理性地构建了含有不同组合元器件的工程菌(GroES-HB8-sHSP-HB8、 SOD-MB4-SOD-HB8和SOD-MB4-GroS2-MB4)。42°C发酵显示,所有的工程菌均比对照生长状况良好,GroES-HB8-sHSP-HB8、SOD-MB4-SOD-HB8和SOD-MB4-GroS2-MB4与含有单个元器件的工程菌的OD660没有差别,但是由于热激蛋白与SOD在SOD-MB4-sHSP-HB8体内发挥了协同作用,从而使得酿酒酵母获得更加优秀的协同耐热性能。(3)利用乙醇合成途径对耐热工程菌、抗氧化工程菌和含有热激蛋白与SOD组合元器件的工程菌(SOD-MB4-sHSP-HB8)进行元器件功能验证。结果表明所有工程菌均比30°C和40°C对照的乙醇产量要高。而SOD-MB4-sHSP-HB8的乙醇产量随着时间的增长幅度最大。(4)将热激蛋白元器件、SOD元器件和组合元器件导入工业酿酒酵母经35°C发酵后,所有的工程菌乙醇产量均比对照高,而含有组合元器件的工程菌表现出更优的乙醇生产性能,为高温发酵生产生物基产品提供了新思路。
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