恶性肿瘤对人类的健康和生命产生了巨大威胁,是中国乃至全世界主要的人口死亡原因之一。根据我国最新癌症统计学数据,肺癌是当今中国死亡率最高的恶性肿瘤,晚期肺癌五年生存率不足15%。根据病理类型,肺癌可分为非小细胞肺癌(Non-small-cell Lung Cancer,NSCLC)及小细胞肺癌(Small-cell Lung Cancer,SCLC),其中NSCLC是肺癌的主要组成部分,占肺癌总数的80-85%。由于缺乏典型的临床表现,NSCLC在诊断初期往往已经是晚期。近年来,尽管NSCLC的治疗在手术、放疗及化疗中都取得了一定的进展,但五年生存率仍较低。乏氧是恶性实体瘤的重要生物学特性之一。近二十年来的临床研究已经明确证实几乎所有恶性实体瘤中都存在一定范围的乏氧区域,是局部晚期实体瘤的特征性病理生理特征之一。乏氧在肿瘤中产生的原因是多样化的,但其根源在于氧气供给不足以及耗氧量增加。在正常组织中,氧气的供给与组织代谢的需求处于平衡状态,但在恶性肿瘤中,由于没有完善的血供以及肿瘤的高代谢状态,最终导致了肿瘤乏氧。同时,由于肿瘤本身以及化疗相关性贫血,进一步使血液中氧含量下降以及肿瘤供氧不足。乏氧会对肿瘤细胞产生巨大影响,比如会提高肿瘤基因组不稳定性、促进肿瘤血管生成、引起肿瘤转移、导致放化疗耐受以及产生不良预后等。与乏氧相对应的则是氧化应激,但二者之间并不矛盾。氧气是线粒体通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(AdenosineTriphosphate,ATP)所必须的,同时,由于氧气分子活泼的化学活性,极易形成活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)。当细胞处于乏氧状态时,由于能量及氧气缺乏,线粒体复合体III中ROS产生急剧增加。ROS是细胞代谢中的正常产物,主要包括超氧化物、过氧化物和氢氧自由基等。线粒体代谢过程中电子传递链是ROS的主要来源。ROS在肿瘤的发生发展中具有重要作用,在正常组织中,细胞内ROS水平通过氧化还原机制控制在平衡状态,而肿瘤细胞内的ROS产生速度远远高于正常细胞。一定水平的ROS会增加肿瘤细胞突变频率,激活增殖相关信号通路,促进肿瘤进展。尽管ROS在一定程度上促进了肿瘤的发生发展,但当ROS水平过高时,则会导致氧化应激而对肿瘤细胞产生致命性损伤,从而成为肿瘤治疗的靶点之一。氧化还原水平的平衡取决于ROS的产生速率与清除系统的清除能力。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、硫氧还蛋白、谷氧还蛋白等多种ROS清除剂在氧化还原稳态中发挥重要作用。在前期关于乏氧的研究中,我们发现乏氧诱导因子-1的表达与肝激酶B1(Liver Kinase B1,LKB1)信号通路密切相关。LKB1是细胞内维持能量及氧化还原稳态的关键分子,LKB1单独突变被认为不能诱导肺癌的出现,但KRAS-LKB1共突变(KL肿瘤)则会诱导肺腺癌、鳞癌或大细胞癌。在关于KRAS肿瘤的研究中,曾有学者提出将KRAS肿瘤根据共突变类型分成三个亚类,KRAS-LKB1共突变是其中重要的一种亚型。KL肿瘤比KRAS突变肿瘤(K肿瘤)生长更快,更容易发生转移,而KL肿瘤通常合并有KEAP1的共突变。KEAP1是细胞氧化应激反应中的重要分子,作为E3泛素连接酶的适配蛋白,正常情况下KEAP1在细胞质中结合到NRF2上并诱导其泛素化,通过蛋白酶体途径降解NRF2,进而影响抗氧化相关基因转录,其中最重要的是谷氨酰胺代谢相关通路基因表达的改变。我们研究发现LKB1突变肿瘤抗氧化应激能力增强,这可能与LKB1突变合并KEAP1突变或NRF2上调进而引起谷氨酰胺代谢增强密切相关。谷氨酰胺的代谢在肿瘤的进展过程中非常关键,其重要性主要体现在其与葡萄糖一样,能够为肿瘤细胞的生长提供大量的ATP,并且是生成细胞内主要还原产物GSH的前体氨基酸。正常细胞及肿瘤细胞均需利用葡萄糖及谷氨酰胺,但需求量存在很大差别。肿瘤细胞对谷氨酰胺的需求远高于正常细胞。谷氨酰胺在谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)催化作用下形成谷氨酸是谷氨酰胺代谢的首要步骤。目前,GLS抑制剂已经进入临床I期实验,但并非对所有患者均有效,寻找合适的生物标记物指导GLS抑制剂的临床应用,对该药在临床上的广泛应用至关重要。目前GLS抑制剂的作用机制仍不清楚。根据谷氨酰胺在细胞中的作用,我们推测GLS抑制剂能够诱导能量应激及氧化应激,进而起到抗肿瘤作用。鉴于LKB1在肿瘤细胞中维持能量及氧化还原稳态中的重要作用,我们进一步探索了LKB1及其他突变对GLS抑制剂抗肿瘤作用的影响。第一部分 红细胞相关指数对非小细胞肺癌患者预后影响的研究[研究目的]1.以乏氧诱因为出发点,分析NSCLC患者术前红细胞相关指数对患者预后的影响;2.通过多因素分析,寻找红细胞相关指数中潜在的NSCLC独立预后因子;3.探索该指标与NSCLC患者临床病理特征之间的关系。[研究方法]1.入组患者:本研究选取了从2006年1月到2009年12月在山东大学附属省立医院胸外科行肺癌根治术的患者,根据入组条件筛选患者入组。2.资料收集:收集患者的姓名、性别、血常规检查(入院后首次检查结果为准)、吸烟史、病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移个数、术式等信息。通过山东大学附属省立医院病案管理系统获取患者临床信息及联系方式。通过电话回访的方式进行随访。3.统计方法:研究首要终点为患者总生存期(Overall Survival,OS),次要研究终点为无进展生存期(Recurrence Free Survival,RFS)。Kaplan-Meier法分析单因素对患者预后的影响并绘制生存曲线。通过log-rank时序检验比较两组之间的差异。通过受试者工作特征曲线比较不同指标对预后的预测能力并确定最佳界值。通过χ2检验(必要时使用Fisher确切检验)或t检验分析红细胞相关指数与临床病理特征之间的关系。预后因子的多因素分析通过Cox风险回归模型进行。单因素分析中p<0.05的变量进入多因素分析。当p<0.05时认为具有统计学差异(双侧检验)。[研究结果]1.患者基本特征:本研究共纳入患者649例,男性患者456例,女性患者193例。在患者的病理分期分布中,早期患者居多,Ⅰ/Ⅱ期患者占研究总人数的72.9%,Ⅲ期患者占27.1%,无Ⅳ期患者入组;2.单因素分析:患者的性别、年龄、术式、肿瘤分化程度、N分期、T分期、肿瘤大小、血红蛋白(Hemoglobin,HGB)、红细胞压积(Hematocrit,HCT)、平均红细胞体积(Mean Corpuscular Volume,MCV)、平均红细胞血红蛋白量(MeanCorpuscularHemoglobin,MCH)以及平均红细胞血红蛋白浓度(Mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)与患者预后相关。红细胞相关指数中,较高水平的HGB、HCT、MCHC、MCV以及MCH与NSCLC患者较好的OS相关。同时,在对RFS的研究中,较高水平的MCH、MCV以及MCHC与较好的RFS也密切相关,但HGB与HCT对RFS影响无统计学意义;3.多因素分析:在利用其它明确预后因子校正后,只有MCHC既是OS的独立预后因子(p=0.032),又是RFS的独立预后因子(p=0.010)。MCV仅仅是OS的独立预后因子(p=0.018),但不是RFS的独立预后因子(p=0.059)。其它红细胞相关指标,如HCT、HGB以及MCH等仅在单因素分析中有意义,但在多因素分析中没有意义,证明这些预后因子并非独立预后因子;4.MCHC与临床病理因素的相关性分析:低MCHC水平与男性(p=0.02)、较高吸烟指数(p=0.002)、较高T分期(p=0.018)以及较大肿瘤体积(p=0.004)密切相关。[研究结论]1.单因素分析中,MCHC、MCH及MCV均对NSCLC患者OS及RFS有影响,但HGB、HCT仅影响患者OS;2.在非贫血NSCLC患者中,MCHC是预测OS及RFS的独立预后因子,MCV是预测OS的独立预后因子,但不是预测RFS的独立预后因子;3.低MCHC水平与男性、较高吸烟指数、较高T分期以及较大肿瘤体积密切相关。第二部分 能量及氧化应激对KRAS突变NSCLC治疗作用研究[研究目的]1.LKB1与KEAP1/NRF2在维持细胞内能量及氧化还原稳态中的作用;2.KEAP1/NRF2通路在LKB1缺失NSCLC中对能量及氧化还原稳态的调控作用;3.LKB1及KEAP1/NRF2对谷氨酰胺代谢的调控及各突变类型细胞对谷氨酰胺的依赖性;4.GLS抑制剂对NSCLC治疗作用;5.LKB1及KEAP1/NRF2通路对GLS抑制剂抗肿瘤作用的影响。[研究方法]1.利用肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据对KRAS突变NSCLC进行共突变分析,利用基因富集分析(Geneset Enrichment Analysis,GSEA)研究KEAP1突变对NSCLC可能的影响;2.利用慢病毒感染或CRISPR/cas9构建稳定过表达或敲除细胞系(LKB1及KEAP1过表达和KEAP1敲除),利用siRNA敲除NRF2;3.利用磺酰罗丹明B细胞染色法、克隆形成实验及CellTiter-Glo检测细胞增殖或细胞活力,利用BrdU及PI法检测细胞周期,利用AnnexinV/7-AAD检测细胞凋亡,利用DCFDA检测细胞ROS水平,利用蛋白质免疫印迹检测蛋白表达,利用ATPlite检测细胞内ATP水平,利用相应试剂盒检测细胞内各种代谢产物含量,利用2-NBDG检测细胞葡萄糖摄取水平。[研究结果]1.共突变分析显示,在NSCLC中,KRAS与LKB1及LKB1与KEAP1之间存在明显共突变;2.LKB1能够维持肿瘤细胞能量及氧化还原稳态,LKB1缺失细胞对能量应激敏感但对氧化应激耐受;3.LKB1可以通过KEAP1非依赖性途径调控NRF2的表达;4.LKB1及KEAP1共同调控谷氨酰胺代谢及细胞对谷氨酰胺的依赖性;5.GLS抑制剂CB-839及IACS-006274具有良好的抗肿瘤活性,能够通过周期抑制引起肿瘤细胞增殖抑制,但不能诱导肿瘤细胞凋亡;6.GLS抑制剂能够诱导肿瘤氧化应激及能量应激,且其肿瘤抑制作用能被丙酮酸及还原剂所挽救;7.GLS抑制剂可以完全抑制KRAS-LKB1-KEAP1肿瘤细胞的增殖,部分抑制KRAS-LKB1突变或KRAS-KEAP1突变肿瘤细胞的增殖,但几乎不能抑制KRAS单独突变肿瘤细胞的增殖。[研究结论]1.LKB1突变肿瘤能够通过KEAP1突变或KEAP1非依赖途径诱导上调NRF2的表达,并产生对谷氨酰胺的依赖;2.GLS抑制剂发挥抗肿瘤作用是通过诱导能量及氧化应激作用而产生的;3.GLS抑制剂对KRAS-LKB1-KEAP1共突变肿瘤效果最好,可能成为GLS抑制剂临床用药的生物标记物。