研究背景随着现代医学的发展进步,组织和器官移植已经成为了多种疾病的重要治疗措施,然而,移植免疫排斥反应依旧是制约其技术发展的主要问题。尽管使用免疫抑制剂可以延长同种异体移植物的存活时间,但由此可能导致的多种副作用和机会性感染风险的增加仍然限制了它的应用,而且终生服药也给患者造成了极大的负累。因此,寻找一种能够诱导异体移植免疫耐受、延长移植物存活时间且毒副作用小、安全系数高的方法,是移植技术中亟待解决的重要问题。间充质干细胞(MSC)最初由Friedenstein于1976年在骨髓中发现,是一类具有自我更新能力和多谱系分化能力的成体干细胞,广泛存在于体内的各类组织,尤其是结缔组织和器官间质之中,比如骨骼肌、脂肪、骨髓、胎盘甚至外周血,其中在骨髓中含量最为丰富。骨髓间充质干细胞(BMSC)在体外培养环境下可呈现为多角状、纺锤状或长梭状成纤维细胞样形态;在特定的培养环境中,可被诱导分化成为多种组织细胞,比如成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞,甚至还可以分化成为心肌细胞、肺上皮细胞、肝脏细胞以及神经细胞等等。BMSC能够表达多种表面抗原,比如SH2、SH3/CD29、CD44、CD75、CD90、CD105等,低表达造血干细胞特征性表面抗原CD14、CD34及CD45等,但其特异性抗原仍未被发现。与此同时,BMSC低表达主要组织相容性复合体-I(MHC-I)类分子,不表达MHC-II类分子,以及B7-1、B7-2、CD40、CD40L、CD80等激活T细胞所必需的共激活分子,这使BMSC具有免疫豁免性,大大的扩展了其临床应用范围。同时BMSC能够通过与多种免疫细胞之间的直接接触而直接作用或者通过旁分泌多种可溶性细胞因子间接作用,从而对其分化、增殖等起到调节作用,进而起到调节免疫进程的作用。BMSC的这些免疫学特性使其在组织器官移植、组织损伤修复以及自身免疫性疾病的治疗中具有了更大的临床应用潜力,受到了诸多学者的重视和研究。转化生长因子-β(TGF-β)亚家族包括至少六种亚型(TGF-β 1-6),仅有三种亚型(TGF-βl、TGF-β2、TGF-β3)在哺乳类动物体内表达。其中,TGF-βl广泛存在于体内各种正常细胞和转化细胞内,具有广泛的生物学作用,能够趋化成纤维细胞、刺激其增殖与分化、参与细胞外基质(ECM)的形成、促进血管内皮细胞增殖从而有利于血管的生成等等,参与创伤修复、免疫应答、肿瘤发生发展、纤维化等多项生理过程。另外,TGF-β能够抑制效应性T细胞的激活与增殖、抑制T细胞向CTL的的分化、干扰CD4+T细胞分化成为Th1细胞、上调Treg细胞的表达,还能抑制B细胞、巨噬细胞和NKC的激活,具有较强的免疫抑制作用。随着研究的不断进行和深入,研究者发现并证实了BMSC可应用于多种疾病的治疗。在移植物抗宿主疾病(GVHD)患者中早期应用BMSC能够显著提高其一年存活率。在多种组织器官移植(包括肾脏移植、肝脏移植、皮肤移植等)的患者中,BMSC均能够有效地诱导移植物免疫耐受,能够保护移植物、改善移植物功能、延长移植物存活时间。在心肌缺血、脊髓小脑性共济失调(SCA)、多发性硬化(MS)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、终末期肝病等疾病的患者中,BMSC能够显著改善损伤器官的功能,进而有效地改善患者的临床症状,减轻疾病给患者带来的痛苦。在自身免疫性疾病,比如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、克罗恩病的患者中,BMSC也表现出了治疗的有效性。关于TGF-β应用于组织器官移植患者中的研究也发现,其能够明显抑制早期急性排斥所导致的炎症反应,减轻排斥反应对移植物的损伤,明显延长移植物的存活时间。然而,研究同时也发现,在移植免疫排斥反应后期,TGF-β可导致移植物的纤维化和血管病变,从而影响到患者的生存时间和生存质量,这显著的限制了TGF-β未来在临床的应用。作为已经被公认的免疫抑制因子——BMSC和TGF-β,它们在诱导移植免疫耐受方面均具有较强的作用,这使得我们不禁想知道两者联合会产生什么效果。为了探明BMSC和TGF-β联合作用对免疫调节的影响,本课题从体外和体内两方面对其进行研究,并通过检测相关指标探讨其发生的机制,以期为临床可用的实现诱导移植免疫耐受的BMSC治疗方案提供新的思路。同时,鉴于直接应用TGF-β可能对机体产生不良影响,本课题将TGF-β预处理BMSC的方法作为两者联合作用的具体手段,以避免将其直接应用于受体体内;由于相较于其他移植模型,皮肤移植模型更简单易得并便于观察,因此选取小鼠皮肤移植作为体内研究的实验模型。目的从体外和体内两方面探究BMSC和TGF-β联合作用对于诱导移植免疫耐受的影响,并通过检测相关指标进一步探讨其发生的机制,以期为BMSC诱导移植免疫耐受的临床治疗方案提供新的思路。方法1.选取Balb/c小鼠的股骨和胫骨作为BMSC提取对象,以贴壁培养法提取细胞,并在体外进行培养、传代。通过观察所提取细胞的形态学、流式细胞技术检测其表面标记、不同方向诱导分化检测其成骨分化和成脂分化的能力,用以鉴定所提取细胞是否为BMSC。2.将不同比例的BMSC与ConA刺激后的T淋巴细胞共培养,用MTT法检测T淋巴细胞的增殖程度;用不同浓度的TGF-β预处理BMSC后,将其与ConA刺激后的T淋巴细胞共培养,用MTT法检测T淋巴细胞增殖程度。3.采用Balb/c小鼠作为供体,C57BL/6小鼠作为受体建立小鼠皮肤移植模型。4.将BMSC和经过TGF-β预处理后的BMSC(BMSC-TGF-β)进行CM-Dil标记,经尾静脉输注到皮肤移植模型受体小鼠体内,在皮肤移植术后第7天采集移植皮片样本观察其是否迁移至移植创面。5.将BMSC和BMSC-TGF-β经尾静脉输注到皮肤移植模型受体小鼠体内,观察移植皮片的存活时间,并在移植术后不同时间点采集移植皮片样本,观察移植皮片的大体观和镜下病理、采集小鼠脾脏样本以流式细胞术检测其中CD4+CD25+Foxβ3+Treg的增殖情况、采集小鼠外周血样本以ELISA法检测其中IL-2、TGF-β、IL-10、IFN-γ的表达情况。结果1.以贴壁培养法能够成功地从Balb/c小鼠股骨和胫骨中提取到足够数量的BMSC,其在倒置显微镜下呈现纺锤状形态,形态均一,并且为集落样生长;应用流式细胞技术检测其表型,结果为阳性表达CD44和CD90,阴性表达CD14和CD45;对其进行诱导分化,结果显示其能够向成骨细胞和脂肪细胞分化,由此验证了所提取细胞即为BMSC。2.在体外环境下,BMSC能够显著抑制ConA刺激所导致的T淋巴细胞增殖,且其抑制作用与BMSC浓度成正比;不同浓度TGF-β预处理后的BMSC仍然能够显著抑制ConA刺激所导致的T淋巴细胞增殖,但较未经过预处理的BMSC,其抑制作用受到了削弱。3.经小鼠尾静脉输注到受体小鼠体内后,在移植术后第7天所取的皮片样本的移植创面中,可观察到CM-Dil标记后的BMSC和BMSC-TGF-β。4.在小鼠皮肤移植模型中,空白对照组较其他两组的受体小鼠移植皮片更早地出现了大面积结痂或坏死脱落现象,其存活时间仅为8.0±1.05天;BMSC组的受体小鼠移植皮片的存活时间得到了明显延长,为12.5±1.35天;而BMSC-TGF-β组移植皮片的存活情况介于两组之间,为10.6±1.90天;任意两组之间比较均具有显著性差异(p<0.05)。移植术后第3、7、10、14天,BMSC组受体小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例均明显高于空白对照组(p<0.05);在术后第3、7、14天,BMSC-TGF-β组受体小鼠的脾脏Treg细胞的比例也明显高于空白对照组(p<0.05);并且BMSC组中Treg细胞的增殖明显早于BMSC-TGF-β组(p<0.05)。在移植术后第7、10天,相较于空白对照组,BMSC组和BMSC-TGF-β组中IFN-γ和IL-2的表达均受到显著抑制、IL-10和TGF-β的表达均受到显著增强(p<0.05);在术后第14天时,BMSC对IFN-β和IL-2表达的抑制作用和对IL-10表达的增强作用仍明显(p<0.05),但对TGF-β的表达却转为显著抑制作用(p<0.05),同时,BMSC-TGF-β对IL-2表达的抑制作用和对IL-10、TGF-β的增强作用虽仍明显(p<0.05),但其对IFN-γ表达的抑制作用己减弱到与空白对照组类似(p>0.05)。结论1.BMSC能够成功的从小鼠股骨和胫骨骨髓中提取,并且在体外易于培养并传代,与此同时也能够保持细胞生物学特性的稳定。2.经尾静脉注射后,BMSC及BMSC-TGF-β均能迁移至皮肤移植模型受体小鼠移植创面。3.在体外实验和小鼠皮肤移植模型中,BMSC都表现出了较强的免疫抑制作用。4.TGF-β能够部分逆转BMSC的免疫抑制作用,在体外实验和小鼠皮肤移植模型中均是如此。5.BMSC的免疫抑制作用和TGF-β对BMSC免疫抑制作用的部分逆转作用可能与其不同程度地调节Treg细胞和IL-10、TGF-β、IL-2、IFN-γ的表达有关。