【摘 要】
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紫斑牡丹（Paeonia rockii）种子富含丰富的α-亚麻酸,是我国重要的油料木本植物。为探究紫斑牡丹的脂肪酸积累分子机制,本实验研究了两个调控脂肪酸合成的上游转录因子PrASIL1与PrNF-YC2,实验对两个基因进行了克隆,生物信息学分析,并通过转化拟南芥研究了它们的功能特性。主要研究结果如下:1.筛选克隆了两个紫斑牡丹脂肪酸相关转录因子PrASIL1和PrNF-YC2,对其生物学特性、表
【基金项目】
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油用牡丹新品种选育及高效利用研究与示范基金（编号:201404701）；
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紫斑牡丹（Paeonia rockii）种子富含丰富的α-亚麻酸,是我国重要的油料木本植物。为探究紫斑牡丹的脂肪酸积累分子机制,本实验研究了两个调控脂肪酸合成的上游转录因子PrASIL1与PrNF-YC2,实验对两个基因进行了克隆,生物信息学分析,并通过转化拟南芥研究了它们的功能特性。主要研究结果如下:1.筛选克隆了两个紫斑牡丹脂肪酸相关转录因子PrASIL1和PrNF-YC2,对其生物学特性、表达模式进行了分析紫斑牡丹转录组数据中筛选获得了两个与脂肪酸合成相关的unigenes,采用普通PCR扩增技术克隆获得两个转录因子PrASIL1,PrNF-YC2。PrASIL1基因c DNA长度为858bp、编码285个氨基酸且PrASIL1蛋白含有GT家族的三螺旋结构;PrNF-YC2基因c DNA长度为534bp,编码177个氨基酸且PrNF-YC2蛋白中有典型的HAP5保守结构域。系统进化树分析,PrASIL1基因编码的氨基酸序列和葡萄中的ASIL基因编码氨基酸序列高度同源,而PrNF-YC2与棉花同源性较高。通过洋葱表皮亚细胞定位分析,PrASIL1,PrNF-YC2都定位于细胞核中。荧光定量PCR反应表明PrNF-YC2与PrASIL1基因在紫斑牡丹不同组织中都有表达且均在种子中转录水平最高,PrASIL1在授粉后20天转录水平最高,在胚胎发育的早期发挥作用;PrNF-YC2在授粉后40天转录水平最高,50天时期表达下降后60、70天时期上升,在种子脂肪酸积累后期发挥作用。2.PrASIL1和PrNF-YC2转录因子均能在拟南芥中调控脂肪酸的合成,但下游脂肪酸相关基因表达及脂肪酸变化不同。通过花序浸染法在野生型拟南芥中过表达PrASIL1、PrNF-YC2,可使拟南芥种子中脂肪酸相关结构基因表达发生变化,与野生型拟南芥相比,过表达PrASIL1的拟南芥种子中脂肪酸合成和三酰甘油转移相关基因FAD3、FAD2、LEC1、LEC2、FUS3、LPAAT1、GPAT9、WRI1、DGAT1、PDAT2转录水平降低;PrNF-YC2转录因子在野生型拟南芥中过表达后,与脂肪酸合成相关基因PK、GPDH、GPDHP、KASI、BCCP2、FAD3、FAD2、PDAT1转录水平升高;表明PrNF-YC2转录因子对脂肪酸合成相关基因的表达发挥正调控作用,PrASIL1转录因子对脂肪酸相关基因的表达发挥负调控作用。使用电子显微镜观察过表达后的成熟拟南芥种子,过表达PrASIL1的拟南芥种子与野生型比较长度有所增加,asil突变体拟南芥种子与野生型比较宽度增加,长度减小。过表达PrNF-YC2基因的拟南芥种子与野生型种子比较长度略微增加,nf-yc2突变体长宽数据与野生型相差无几,色泽无差异,均为黄褐色。通过GC-MS测定分析了异源表达PrASIL1、PrNF-YC2基因的纯合T3代及野生型拟南芥种子脂肪酸。与野生型拟南芥相比,过表达PrASIL1拟南芥种子总脂肪酸含量减少,且主要是C18:1、C18:2、C18:3、C20:1含量降低。过表达PrNF-YC2基因拟南芥种子总脂肪酸含量较野生型显著增加,其中C18:1、C18:2、C18:3、C20:1含量明显高于野生型。表明PrASIL1基因对紫斑牡丹脂肪酸积累发挥抑制作用,PrNF-YC2基因对脂肪酸积累发挥促进作用。
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