骨重建是一个骨质分解及合成代谢的动态过程,并且贯穿人的一生。据报道,在成年人当中每年约10%的骨骼经历重建和再生；承担此任务的主要是两类细胞：负责骨质吸收的破骨细胞和参与骨质合成的成骨细胞。破骨细胞来源于单核巨噬细胞系(BMMs)中的造血干细胞,成熟的破骨细胞是一种具有骨吸收功能的多核巨细胞。破骨细胞的增殖、分化及成熟受到两个关键的细胞因子所调控：巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF),核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)。 M-CSF主要作用于单核巨噬细胞使其向破骨前体细胞分化增殖,并促进破骨前体细胞特异性表达核因子-κB受体活化因子(RANK),同时还参与成熟破骨细胞的活化、黏附及迁徙。RANKL是一种Ⅱ型膜联蛋白,属于肿瘤坏死因子配体家族。在与其特异性受体RANK结合后,在M-CSF的协同作用下,RANKL对破骨细胞的进一步分化及发挥骨吸收功能起决定性作用。成骨细胞来源于间充质干细胞,分化成熟的成骨细胞能够分泌胶原和糖蛋白,并产生细胞外骨基质及矿化组织。同时在骨骼微环境内,成骨细胞在分化成熟过程中分泌大量细胞因子,从而影响破骨细胞的分化及功能。如上所述,对破骨细胞分化成熟起关键性作用的RANKL和M-CSF主要来源于成骨细胞；此外,成骨细胞还分泌Ⅰ型胶原及骨钙素等化学趋化因子,调节破骨前体细胞的迁徙。在1997-1998年间,RANKL首次被克隆合成并证实其参与调节对破骨细胞的分化融合及骨吸收功能。RANKL基因编码两种不同功能的蛋白形式：两种形式的Ⅱ型膜联蛋白(RANKL1/2)和一种分泌性蛋白(RANKL3)。其中与破骨细胞表面特异性RANK受体结合的是RANKL1 。 RANKL在全身多个组织器官中都有较高的表达,如乳腺、胸腺及肺脏等。在骨骼系统中,成骨细胞和骨髓基质细胞为RANKL的主要来源。此外,RANKL的分泌还受到多种激素或细胞因子的影响：如甲状旁腺激素、前列腺素E2、肿瘤坏死因子a、白介素-1/6/11、1-25-(2)羟基维生素D3等可以上调RANKL的分泌水平；而雌激素、雄性激素、转移生长因子-p及干扰素-γ则对RANKL的分泌起抑制作用。目前大量文献表明,RANKL介导的破骨细胞功能亢进与各种类型的病理性骨溶解有着密切关系,例如：肿瘤导致的骨质破坏、炎症性的骨溶解、人工关节置换术后无菌性假体松动、绝经后骨质疏松症、Paget’s病、银屑病性关节炎及强直性脊柱炎等等。因此,RANKL作为治疗破骨细胞相关性骨溶解的一个理想靶点,在临床应用上有着广阔的前景。花色苷作为一种水溶性色素,是构成植物王国中果实和花瓣颜色的主要成分之一；作为花青素的糖苷化形式,花色苷属于黄酮类。花青素的基本化学结构为2一苯基苯并吡喃,是一种阳离子。花青素是一种酚类化合物,其包括以下六个亚型：飞燕草色素、矢车菊素、牵牛花色素、天竺葵色素、芍药色素和锦葵色素。此外,花青素可以直接口服并迅速进入全身血液循环,因此其具有很高的生物利用率。近年来,大量文献报道花青素及花色苷具有抗肿瘤,抗炎症反应和抗氧化应激等方面的活性。矢车菊素被认为是花青素化合物在自然界中分布最广的亚型,其主要分布于各种蔬菜、瓜果、豆类及红酒之中；在欧美等国家成人平均每日摄入量在10mg以上,相关报道亦证实长期摄入矢车菊素具有降低癌症、心血管疾病和糖尿病等发病率的作用。尽管国内外大量研究已经对矢车菊素的化学活性,治疗相关疾病的临床前期研究及其机制做了较为详细的阐述；但是上述报道主要针对矢车菊素的糖苷形式(C3G:cyanidin-3-glycoside)。然而作为矢车菊素的氯化物单体形式,氯化矢车菊素(Cyanidin Chloride, CY)仅被报道具有保护水杨酸类药物引起的胃肠粘膜损伤作用。到目前为止,关于氯化矢车菊素在溶骨性疾病的治疗效果及其相关机制的研究未见报道。本实验通过细胞生物学和现代分子生物学技术,在体外环境中观察氯化矢车菊素对破骨细胞的增殖、分化及骨吸收功能的影响；并在分子水平上探究其可能的影响机制。进而,通过构建卵巢切除所致的骨质疏松小鼠动物模型,进一步验证氯化矢车菊素在体内实验中对绝经后骨质疏松症等破骨细胞所致溶骨性疾病的疗效。实验内容包括以下三个部分：第一部分骨髓单核巨噬细胞的分离和培养,及向破骨细胞定向诱导分化模型的建立和破骨细胞的生物学性状分析目的：建立以小鼠骨髓单核细胞为来源的破骨细胞体外分离培养体系,通过形态学特点及骨吸收功能等方面对破骨细胞进行鉴定。方法：通过全骨髓细胞贴壁法分离提取骨髓单核细胞(BMMs)。之后在M-CSF和RANKL的刺激下,进行骨髓造血细胞体外培养、扩增,并诱导其向破骨细胞定向分化。通过细胞形态学观察,抗酒石酸酸性磷酸酶染色及骨吸收能力的检测等方法对破骨细胞进行鉴定,以确定骨髓单核细胞体外分离培养体系向破骨细胞分化的能力及稳定性。结果：在M-CSF作用下,骨髓细胞呈长梭形,以贴壁方式生长,增殖旺盛。加入RANKL刺激后,细胞逐步分化融合为空泡状多核巨细胞,即成熟的破骨细胞。该多核巨细胞在抗酒石酸酸性磷酸酶染色时呈阳性反应；并且具有骨吸收功能,能在皮质骨板上形成骨吸收陷窝。结论：骨髓细胞贴壁培养及M-CSF/RANKL联合刺激培养体系可以提供稳定且充足的破骨细胞,对进一步体外药物干预实验具有重要意义。第二部分 成骨细胞分离培养模型的建立,及生物学性状分析目的：小鼠原代成骨细胞的分离提取、培养、形态学观察及功能鉴定。方法：取新鲜小鼠颅盖骨,剪碎并碾磨后经胰酶替代物消化；消化液离心,弃上清液后以含15%小牛血清的DMEM溶液培养于12孔细胞培养板；待细胞铺满后加入诱导分化液。最后,对分化成熟的细胞进行碱性磷酸酶活性及钙结节检测以鉴定其生物学特性。结果：成熟的成骨细胞为梭形,贴壁生长并能形成细胞突触,生长旺盛。加入分化液,经过7天诱导分化后能产生大量碱性磷酸酶,碱性磷酸酶染色阳性；经过2周分化液培养后能在细胞培养板上形成矿化结节,即钙结节。结论：从小鼠颅骨分离提取原代成骨细胞,并用分化液在体外诱导分化成熟,是稳定可靠的成骨细胞分离培养体系。第二部分 成骨细胞分离培养模型的建立,及生物学性状分析目的：小鼠原代成骨细胞的分离提取、培养、形态学观察及功能鉴定。方法：取新鲜小鼠颅盖骨,剪碎并碾磨后经胰酶替代物消化；消化液离心,弃上清液后以含15%小牛血清的DMEM溶液培养于12孔细胞培养板；待细胞铺满后加入诱导分化液。最后,对分化成熟的细胞进行碱性磷酸酶活性及钙结节检测以鉴定其生物学特性。结果：成熟的成骨细胞为梭形,贴壁生长并能形成细胞突触,生长旺盛。加入分化液,经过7天诱导分化后能产生大量碱性磷酸酶,碱性磷酸酶染色阳性；经过2周分化液培养后能在细胞培养板上形成矿化结节,即钙结节。结论：从小鼠颅骨分离提取原代成骨细胞,并用分化液在体外诱导分化成熟,是稳定可靠的成骨细胞分离培养体系。第三部分 氯化矢车菊素对卵巢切除所致骨溶解的疗效及其分子机制目的：观察氯化矢车菊素对卵巢切除所致骨溶解及RANKL介导的破骨细胞过度生长的作用,并阐明其分子机制。方法：建立卵巢切除动物模型,通过Micro-CT及病理学检查结果对骨骼形态学、破骨细胞的参数进行比较分析,观察氯化矢车菊素对卵巢切除所致骨溶解的疗效。通过骨髓单核细胞体外分离培养,TRAP染色及细胞计数、MTS细胞活力测定和流式细胞仪凋亡检测、骨吸收实验等,分别检测氯化矢车菊素对破骨细胞的形成及骨吸收功能的影响,同时观察其对破骨前体细胞的细胞毒性；进而借助实时荧光定量RT-PCR检测、Western-blot蛋白印迹测量、Luciferase萤光素酶报告基团系统分析、钙离子震荡、酸化实验等方法,探究氯化矢车菊素对破骨细胞分化及骨吸收功能的调控机制和所涉及的细胞信号传导通路。此外通过成骨细胞体外分离培养体系,观察氯化矢车菊素对成骨细胞功能的影响。结果：氯化矢车菊素能有效地缓解卵巢切除所导致的小鼠全身系统性骨质疏松。同时,体外试验证实氯化矢车菊素通过减缓IκB-α的降解、抑制ERK的磷酸化以及干扰RANKL介导的细胞内钙离子流动,从而抑制了RANKL信号传导通路中NFATc1和c-Fos等转录因子的活化,最终抑制了破骨细胞的分化及功能。而且体外试验结果显示,氯化矢车菊素还能上调成骨细胞碱性磷酸酶的活性并促进其矿化能力。结论：氯化矢车菊素对卵巢切除导致的骨质疏松有保护作用。其机制为,氯化矢车菊素抑制了RANKL介导的破骨细胞过度增殖及骨吸收作用；同时促进成骨细胞的分化及成骨作用。