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目的 使用血管紧张素II(Angiotensin II, ANG II)刺激RAW264.7巨噬细胞,探讨其对巨噬细胞极化及对高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1, HMGB1)分泌的影响,并进一步研究其机制。 方法 (1)ANG II对HMGB1分泌的影响 用不同浓度ANG II(0,10nmol/L,100nmol/L,1μmol/L,10μmol/L)处理RAW264.7巨噬细胞相应时间(0,3h,6h,9h,12h),提取细胞总RNA与总蛋白,RT-qPCR和western blot分别检测HMGB1 mRNA和蛋白水平。免疫荧光技术检测巨噬细胞 HMGB1 的核浆转移;ELISA 检测细胞培养上清 HMGB1 蛋白水平。 (2)ANG II诱导HMGB1分泌的分子机制 ANG II 处理巨噬细胞后用免疫共沉淀技术检测 HMGB1 乙酰化以及与HMGB1结合的SIRT1 蛋白水平;western blot检测JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平。细胞用通路蛋白抑制剂Niclosamide、HBC预处理2h后,再加入ANG II刺激,western blot检测JAK2、STAT3蛋白磷酸化以及HMGB1表达水平的改变。 (3)ANG II诱导巨噬细胞分泌的HMGB1有利于巨噬细胞的极化 Western blot检测ANG II和HMGB1刺激巨噬细胞后iNOS蛋白水平,ELISA检测细胞因子水平。细胞分为不同处理组:对照组,EP+ANG II组,SB+ANG II组,ANG II组,western blot检测巨噬细胞HMGB1以及iNOS蛋白的表达。进一步运用HMGB1 siRNA特异性抑制HMGB1,收集ANG II 刺激后细胞培养上清以及HMGB1 siRNA处理后细胞培养上清,实验分为:对照组,ANG II培养上清与巨噬细胞共培养组, ANG II 培养上清+氯沙坦与巨噬细胞共培养组, HMGB1 siRNA 培养上清与巨噬细胞共培养组,HMGB1 siRNA 培养上清+氯沙坦与巨噬细胞共培养,western blot检测iNOS。 (4)HMGB1对ANG II及AT1R表达的影响 用不同氧化还原状态的 HMGB1 处理巨噬细胞及原代单核-巨噬细胞, western blot检测AT1R蛋白表达,ELISA检测细胞培养上清ANG II的表达。 结果 (1)ANG II能以剂量和时间依赖方式促进HMGB1的分泌,并且10μmol/L ANG II处理巨噬细胞12小时作用最佳;免疫荧光显示ANG II处理9小时HMGB1即发生明显的核浆易位。ELISA结果显示细胞培养上清HMGB1明显增加。 (2)免疫共沉淀结果显示,ANG II能促使HMGB1与SIRT1发生解离,增加HMGB1乙酰化水平。Western blot结果显示ANG II处理后细胞内JAK2/STAT3磷酸化水平均增高;细胞给予Niclosamide、HBC 预处理2h后,JAK2/STAT3磷酸化水平均降低,HMGB1表达水平也降低。 (3) EP+ANG II组,SB+ANG II组巨噬细胞HMGB1表达降低的同时, iNOS蛋白水平也降低,即EP与SB减弱ANG II引起的巨噬细胞极化。HMGB1 siRNA培养上清中几乎无分泌的HMGB1,相比ANG II培养上清与巨噬细胞共培养组,HMGB1 siRNA培养上清或HMGB1 siRNA培养上清+氯沙坦与巨噬细胞共培养组iNOS蛋白水平明显降低。 (4)HMGB1具有促进巨噬细胞ANG II及其受体AT1R表达增加的能力,尤其是二硫键型HMGB1(ds-HMGB1)。 结论 (1)ANG II能通过促进巨噬细胞分泌HMGB1,诱导巨噬细胞重编程为M1型,同时分泌的 HMGB1 可以通过正反馈促进巨噬细胞表达 ANG II 及其受体AT1R。 (2)ANG II能促使HMGB1与去乙酰化酶SIRT1发生解离,增加HMGB1的乙酰化,并通过JAK/STAT信号通路调节HMGB1的分泌。