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D1蛋白酶(CtpA)是由叶绿体核CtpA基因编码的分子量大小约为45 kDa的蛋白质。它的作用是剪切D1蛋白前体(pD1)的羧基端延伸肽段,使pD1转变成为成熟D1蛋白(mD1),从而进行锰簇合物的组装,这个过程是光合系统Ⅱ中损伤-修复循环的重要环节。由于CtpA是光合作用过程中不可缺少的一种蛋白酶,而且在植物体内的含量仅为D1蛋白含量的1%,因此CtpA被认为是一种新型的除草剂靶标。
药物筛选过程需要建立合适的筛选方法。高效液相色谱法、极化荧光法(FP)等方法曾先后被用于CtpA抑制剂先导化合物的筛选。其中高效液相色谱法是一种中通量的筛选方法,极化荧光法能够实现高通量的筛选但需要对底物进行标记,因此,我们希望能够建立一种简单、快速、可靠的筛选方法。
在本文中,我们表达纯化了重组D1蛋白酶,采用亲和层析和凝胶过滤层析的方法得到了较高纯度的D1蛋白酶,高效液相色谱法测得其比活力为1.77 nmol·mg-1·min-1。利用重组蛋白酶分别免疫大白兔和小鼠制备了多克隆抗体和单克隆抗体。采用表面等离子共振(SPR)技术研究了抗体与CtpA的结合,通过氨基偶联的方法将抗体固定至CM5芯片,通过不同浓度抗体与CtpA结合的实验,得到两者的亲和常数(KA)为9.1×107(M)-1。溶液竞争法证实抗体与CtpA的结合位点也是CtpA与其底物的结合位点,因此可以用抗体作为探针对CtpA的抑制剂先导化合物进行筛选。
在此基础上,我们建立了两种以抗体作为探针的先导化合物筛选方法-酶联免疫吸附法(ELISA)和表面等离子共振法(SPR),用这两种方法对本课题组合成的一些抑制剂先导化合物进行了筛选,这些抑制剂对CtpA具有不同程度的抑制作用,抑制率在14.8%-46.2%之间,并采用高效液相色谱法对这两种方法的可行性进行了确认。