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转座子是一类能够在基因组中移动的片段,其过程叫做转座。随着多个基因组测序计划的进行,原核和真核生物界陆续发现众多转座子,转座子因此被认为是自然界变异和进化的重要推动力之一。自主的DNA转座子能编码活性转座酶以介导转座过程,但由于受到来自宿主的钝化作用,到目前为止在自然界生物体内发现的具有天然活性的转座子很少,Tgf2是发现的第二个具有天然活性的脊椎动物转座子。Tgf2属于h AT超家族,它首先在我国的金鱼(Carassius auratus)中发现,能编码完整、具有活性的转座酶,能够介导转座,是有潜力的鱼类遗传学工具之一,因此在鱼类重要性状主控基因的筛选、功能解释及育种等有的广泛的应用。本研究室得到的Tgf2转座子能够编码3种Tgf2转座酶。目前这3种不同长度的转座酶在E.coli Rosetta1(DE3)内得到表达。鉴于E.coli BL21(DE3)菌株表达外源蛋白有更高的效率和稳定性,所以本研究根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化并合成了金鱼Tgf2转座酶编码区基因,与p ET-28a(+)载体重组,采用E.coli BL21(DE3)作为宿主菌株,以期获得Tgf2转座酶的高效表达。本研究实验分为五个部分。第一部分内容为Tgf2转座酶的生物信息学分析。通过SOPMA、I-TASSER服务器,分析模拟转座酶的二级结构、结构域以及三级结构,找到转座酶的催化元件,分析与转座酶活性相关的功能域。第二部分内容为金鱼Tgf2转座酶原核表达载体的构建。根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化并合成了金鱼Tgf2转座酶编码区基因Tgf2TP Plus,对Tgf2TP Plus基因序列所在的克隆载体p UC57-simple-Tgf2TP Plus和表达载体p ET-28a(+)进行Bam HI和XhoI位点的双酶切,回收之后通过T4DNA连接酶连接,转化到E.coli DH5α细胞内,根据重组载体序列设计合适的引物,通过PCR扩增,Bio Edit测序比对。结果显示,成功构建了重组载体p ET-28a(+)-Tgf2TP Plus。第三部分内容为重组蛋白的诱导表达。从E.coli DH5α细胞内提取重组质粒p ET-28a(+)-Tgf2TP Plus,转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导表达重组蛋白。结果显示,在低吸光度(OD600=0.3-0.4)和低温(22℃)的条件下没有重组蛋白的表达,在37℃、OD600为0.5条件下,才会有重组蛋白的表达。之后,对时间、IPTG浓度和温度进行优化。结果表明,在诱导时间0-6 h之间,重组蛋白的表达量随着时间的增长而逐渐增加;在6 h-10 h之间,重组蛋白的表达量随着时间的增长并没有明显的变化,并且由于6 h时菌体的浓度较高,所以本实验采取诱导时间为6 h。诱导剂浓度为1.0 mmol/L时目的蛋白的表达量最高,本实验采取常规表达诱导剂浓度1.0 mmol/L。在28℃-37℃温度范围内,重组蛋白的表达在28℃和30℃表达量较高,由于30℃菌体浓度较大,所以本实验采取30℃诱导表达。因此,本实验选择30℃、OD600=0.5,1.0 mM IPTG浓度诱导表达6 h。SDS-PAGE电泳分析,在约70 kDa处有很深的蛋白条带,和预测的已知分子量接近。第四部分内容为重组蛋白的纯化和鉴定。通过SDS-PAGE分析确定E.coli BL21(DE3)菌株能够表达出可溶的重组蛋白。表达的重组蛋白带有His?Tag标签,可以利用镍柱亲和层析的方法将重组蛋白纯化出来。因此,收集诱导表达菌体,细胞破碎后上清液通过镍柱纯化,收集的目的组分进行SDS-PAGE分析。结果表明,得到了较高纯度的重组蛋白,并且重组蛋白的分子量与预测的已知分子量接近。通过MALDI-(TOF)/TOF串联质谱鉴定,确定表达的重组蛋白即为金鱼的Tgf2转座酶。第五部分内容为金鱼Tgf2转座酶体外活性的研究。主要包括DNA结合活性和消化活性。对于DNA结合活性,本实验采取了葡聚糖凝胶层析的方法,DNA结合活性的判断是根据转座酶和DNA探针结合的复合物,使紫外吸收值发生变化。消化活性是通过质粒和转座酶混合反应,利用琼脂糖凝胶电泳检测,观察质粒的变化。实验采用Tgf2左臂的末端重复序列作为DNA探针。结果表明,金鱼的Tgf2转座酶和探针能够发生特异性结合,且结合活性不受探针浓度的影响;金鱼的Tgf2转座酶具有体外切割活性。采用原核表达体系不仅获得高效重组Tgf2转座酶,也为其作为工具酶应用于鱼类生物学研究奠定了必要的基础,并且为得到高活性的转座酶提供了可能。