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在主要农作物中定位表达硒代谢关键酶基因来调节农产品含硒水平,满足人类健康摄硒的需要,具有重要理论与实践价值。利用分子生物学手段分离耐硒基因,再利用转基因技术培育出更多的耐硒植物是未来的发展趋势。 正向遗传学是指,通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变,寻找相关的表型或性状改变,然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因,并揭示其功能。本文从化学诱导型激活标签子系统构建的突变体库中筛选到功能获得型耐硒突变体vsel,初步鉴定对一定浓度的硒盐(亚硒酸钠)具有耐受性,而在正常生长条件下与野生型生长发育没有明显差异,在此基础上通过Tail-PCR克隆VSE1基因,并对其在硒胁迫下的功能进行了研究。 1、从XVE系统激活标签子突变体库中筛选获得耐硒突变体vse1。在5mg/L,Na2SeO3和10μMβ-estradiol+5mg/LNa2SeO3作用下,vse1突变体较WT表现出显著的耐硒性状。遗传分析反应,调控vse1突变体耐硒性状的基因以隐性单基因的调控方式进行。另外,vse1突变体对H2O2胁迫有明显的耐受作用,暗示vse1突变体对硒耐受的途径可能与抗氧化系统有关。 2、采用Tail-PCR技术,克隆了拟南芥VSE1基因(AT1G07890)。VSE1基因编码一个胞质型抗坏血酸过氧化物酶(cAPX),APX是植物体内的重要酶系,是植物AsA-GSH氧化还原途径的重要组分,是清除H2O2的关键酶。氨基酸序列比对分析显示,VSE1基因编码的蛋白质与甘蓝(Brassica oleracea)有较高的相似性。 3、通过对VSE1基因表达模式分析发现,VSE1基因在突变体中被敲除,在各组织中表达水平具有差异性,在果荚中的表达量最高,而在莲座叶中的表达量最低。组织中硒含量测定发现,vse1突变体根中硒含量显著高于WT。分析AtGPX、AtHMT、AtGSH和AtATM等四个硒胁迫相关基因的表达水平发现,硒胁迫下的vse1突变体AtGPX和AtGSH的表达量高于野生型,而AtHMT、和AtATM表达量无差异。另外在硒胁迫下,vse1突变体比WT要更加耐受,而在0.2mMBSO+5mg/L Na2SeO3的培养条件下,vse1突变体对硒耐受表型消失,说明vse1突变体对硒的耐受性可能与GSH途径以及AtGPX和AtGSH表达量增加有关。此外,vse1突变体对H202胁迫响应以及DAB对H202的组化检测说明VSE1基因敲除对硒胁迫耐受可能与抗氧化系统有关。以上研究结果表明VSE1基因通过激活AtGPX和AtGSH,硒螯合以及对对ROS的清除来参与硒胁迫的耐受调节。