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PDLSCs是公认的牙周组织再生中有利的种子细胞,但基质微环境对干细胞的增殖分化起到重要作用,同样PDLSCs的多向分化能力尤其是成骨能力也会受到不利的微环境影响而不能更好地用于牙周组织再生。对此恢复和改善PDLSCs因微环境影响而下降的成骨能力成为我们研究的重点。前期有研究证实PDLSCs通过与HERS共培养,成骨能力会有所增强。HERS是发育期细胞,来源有限,而ERM作为HERS的残余物,是成熟牙周组织中唯一的上皮结构,却一直被认为是一种残余无用的组织。鉴于共培养体系能更好地模拟体内微环境,本实验拟设立ERM与PPDLSCs/Aged-PDLSCs的共培养系统,来探究ERM是否能延续HERS的功能,从而能改善PPDLSCs/Aged-PDLSCs下降的成骨能力,为牙周组织再生提供一种新的模式。实验分为三个部分:1.H/P/Aged-PDLSCs、ERM的分离、培养及鉴定目的:获取实验所需的四种细胞H/P/Aged-PDLSCs,ERM。方法:分别从健康人群,患有牙周炎的患者及衰老组成员拔除的牙齿中通过组织块培养法获取PDLSCs,纯化处理后甲苯胺蓝染色观察细胞克隆形成情况,流式细胞术对细胞表型进行鉴定以及成骨成脂诱导实验鉴定PDLSCs的多向分化能力;从健康人群拔除的智齿选用全牙消化及差别消化法获得ERM,镜下观察细胞生长情况,利用细胞免疫荧光染色实验及RT-PCR技术来对其上皮特性进行鉴定。结果:成功获取了H/P/Aged-PDLSCs,流式检测结果显示间充质特异性标记物CD90、CD105、CD29呈强阳性表达,而造血系相关标记物CD45表达为阴性;成骨诱导实验结果表明三种细胞在诱导组较对照组ALP染色加深,形成的矿化结节增多;成脂诱导实验利用油红染色显示三种细胞诱导组较对照组形成的脂滴大而多。对于ERM,生长状况良好;细胞免疫荧光染色结果CK14阳性表达;与成纤维细胞比较RT-PCR结果显示ERM特异性高表达上皮特异性标记物。结论:H/P/Aged-PDLSCs为间充质细胞特性,具有成骨成脂能力;ERM生长状况良好,为上皮源性细胞。2.ERM对P/Aged-PDLSCs成骨能力的影响目的:探究ERM对于P/Aged-PDLSCs成骨能力的影响。方法:首先利用RT-PCR及Western Blot技术从基因水平及蛋白水平检测了H/P/Aged-PDLSCs的成骨分化能力,验证了微环境对PDLSCs成骨能力的影响;利用transwell小室建立ERM/PPDLSCs、ERM/Aged-PDLSCs间接共培养体系;检测transwell小室下层P/Aged-PDLSCs在共培养组及单独培养组中成骨特异性标记物ALP、Runx-2的基因及蛋白的表达情况,同时进行ALP染色及茜素红染色直观地观察共培养组较单独培养组P/Aged-PDLSCs的成骨能力变化。结果:炎症及衰老微环境下,PDLSCs的ALP及Runx-2的基因及蛋白表达水平均较健康PDLSCs下调;与ERM共培养后较单独培养组,ALP、Runx-2基因及蛋白水平表达均上调;ALP染色加深,矿化结节形成的多且密集。结论:微环境能影响PDLSCs的成骨分化能力,而ERM确实能改善P/Aged-PDLSCs下降的成骨能力。3.ERM对P/Aged-PDLSCs成骨能力影响的分子机制初步探究目的:初步探究ERM对P/Aged-PDLSCs成骨能力影响的分子机制。方法:利用Western Blot技术检测P/Aged-PDLSCs在共培养组及单独培养组Wnt信号通路相关标记物总的β-catenin,活化的的β-catenin及GSK-3β、磷酸化的GSK-3β表达情况。结果:与ERM共培养后较单独培养组,P/Aged-PDLSCs表现为总的β-catenin和GSK-3β表达情况基本没有太大变化,而活化的的β-catenin及磷酸化的GSK-3β表达下调。结论:ERM在对P/Aged-PDLSCs成骨能力影响进程中,Wnt信号通路确实起到一定作用。综上所述,ERM作为HERS的残余物,并非是一种残余无用的组织,可以在一定程度上改善P/Aged-PDLSCs下降的成骨能力,为牙周组织再生提供一定思路。这个过程可能有Wnt信号通路的参与,但具体作用机制还有待进一步研究。