论文部分内容阅读
β-葡聚糖酶是重要的工业用酶,可有效消除谷物β-葡聚糖在酿造和饲料工业中产生的负面影响。与国外相比,我国对β-葡聚糖酶的研究起步较晚,且研制的β-葡聚糖酶的热稳定性普遍较差,不能满足现代啤酒糖化工艺和颗粒饲料造粒的温度要求,因此提高β-葡聚糖酶的热稳定性具有非常重要的意义。本课题以大肠杆菌表达系统克隆和重组表达了β-葡聚糖酶基因;建立了高通量筛选耐热β-葡聚糖酶的方法;以克隆的β-葡聚糖酶基因为起始材料,通过设计的定向进化策略和建立的筛选手段提高野生型β-葡聚糖酶的热稳定性;检验所构建的热稳定性重组菌株的遗传稳定性;对热稳定性突变株EGs2的发酵条件进行优化;筛选并优化出提高β-葡聚糖酶热稳定性的复合保护剂;估算了热稳定性β-葡聚糖酶的储藏寿命。主要研究结果如下: 从Bacillus subtilis ZJF-1A5中克隆了大小为849bp的β-葡聚糖酶基因。通过序列比对,该基因编码的氨基酸序列与Borriss R、Sun,J和Hidetoshi发表的β-葡聚糖酶的氨基酸序列分别有1—3氨基酸的替换。β-葡聚糖酶基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与用同样限制性内切酶切割的载体pET28a(+)进行重组表达,得到了27KD的有活性的β-葡聚糖酶。对酶在宿主细胞中的位置进行测定,结果显示:β-葡聚糖酶不仅分泌至细胞外,而且也存在于细胞内和周质空间。发酵上清液经硫酸氨盐析沉淀和DEAE Cellulose 52离子交换柱层析,纯化的β-葡聚糖酶经SDS-PAGE电泳鉴定,纯化产品为单一条带,分子量约27KD。纯化的β-葡聚糖酶的热学性质研究表明:β-葡聚糖酶的Tm值为62.5℃,最适反应温度为55℃。 本研究将定位膜转印和肉眼可见的平板筛选策略相结合,通过对影响菌落生长、酶的表达和转印成功率的各因素的优化,建立了高通量筛选耐高温β-葡聚糖酶的方法。结果显示:每个LB平板(直径90mm)用4μl 200mg/ml IPTG;IPTG要预先涂在LB平板上;菌落密度约为100个/平板;菌落培养时间为37℃,15小时;完全钝化野生型酶的条件为100℃ 2小时。对该方法的稳定性考察结果显示:该方法的重现性为100%,假阳性率为0.16%,假阴性率为12.22%。与其它高通量筛选方法相比,以滤膜为基础的高通量筛选方法存在许多优点,如透明圈清晰,假阳性率较低,筛选通量高,操作简便,费用低等。该方法作为一种固相酶筛选方法,在鉴别热稳定性和低温下催化活性同时得到提高的变异体时非常有效。 为了提高β-葡聚糖酶的热稳定性,利用体外定向进化技术对编码β-葡聚糖酶的基因进行改造。设计的定向进化策略包括一轮的随机突变和一轮的DNA改组。应用建立的高通量筛选方法筛选热稳定性突变体,最终获得EGs1和EGs2两株热稳定性突变体。通过对野生酶和突变酶的DNA序列和酶学性质分析发现:EGs1和EGs2分别有四个和五个氨基酸替换;这些氨基酸替换使EGs1和EGs2突变酶的Tm值分别比野生酶的Tm值(62.5℃)提高了3℃和5℃,达到了65.5℃和67.5℃;突变酶的最适反应温度也提高了5℃;两个突变酶对地衣多糖的水解能力分别被提高28%和降低21.6%;对地衣多糖的亲和力与野生型的一致,未见改变;在酶的最适pH值上,野生酶和EGs1突变酶为6.5,而EGs2突变酶为7.0;在酶的pH值稳定性方面,野生型和突变型β-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围,在pH 6.0-8.5的范围内放置48h,β-葡聚糖酶仍保持80%以上的酶活力。这一结果说明了定向进化在提高酶的热稳定性方面是比较有效的。